Dissertation Synthese von Gd(III)-Komplexen für die molekulare MRI Zur Erlangung des Grades eines Dr. rer. Nat. dem Fachbereich II (Biologie/Chemie) der Universität Bremen vorgelegt von Dipl. Chem. Timo Dansauer aus Bremen 2008 Für meine Eltern und meine Frau 1. Prüfer Prof. Dr. Dieter Leibfritz (Universität Bremen) 2. Prüfer Prof. Dr. Wolf-Dieter Stohrer (Universität Bremen) 3. Prüfer Prof. Dr. Hans Joachim Breunig (Universität Bremen) Inhaltsübersicht VIII Inhaltsübersicht Inhaltsübersicht..……………………………………………………………………….. VIII 1.0 Einleitung………………………………………………………………………… 1 1.1 Einleitung………………….………………………………………………... 1 1.2 Grundlagen der MR und MR-Bildgebung……………………………...... 8 1.3 Zellmarkierungsansätze von Kontrastmitteln………………………….... 9 1.4 Phospholipide und Zellmembranen……………………………………… 9 1.5 Steroide……………………………………………………………………... 11 1.6 Hydrazinsubstrate…………………………………………………………. 12 1.7 Polyfluorierte und Polytrifluormethylierte Verbindungen……………..... 13 1.8 Neurotransmitter………………………………………………………….... 13 2.0 Aufgabenstellung……………………………………………………………….. 18 3.0 Material und Methoden…………………………….…………………………... 19 3.1 Adrenale Pheochromacytoma Zellen aus der Ratte(PC12)……….… 19 3.2 C6-Glioma Zellen aus der Ratte..…………………………………......... 19 3.3 Zellexperimente und Zellaufarbeitung…………………………...…….. 20 3.4 Agarosegelphantom……………………………………………………… 20 3.5 Eppendorff-Cup-Agarosegelphantom…………….…...……………….. 21 3.6 MR-Messungen am 4,7T Bruker Biospec Tier-Scanner……………… 21 3.7 EPR-Messungen………………………………………………………….. 21 3.8 T1-Zeitbestimmung…………………………………………………..…… 22 3.9 T2-Zeitbestimmung……………………………………………………...... 23 3.10 NMR-Kinetik von Bishydrazid-DTPA-Gd Komplexen…………..…….. 23 4.0 Ergebnisse und Diskussion………………………………………………....... 24 4.1 Bis-hydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexe……..………………………..….... 24 4.1.1 Bis-Phenylhydrazido-DTPA-Ligand und Gd-(III)-Komplex.....…. 24 4.1.2 Bis-2,4-Dinitrophenylhydrazido-DTPA-Ligand und Gd(III)- Komplex……………………………………………………………… 25 Inhaltsübersicht IX 4.1.3 Diskussion der EPR-Spektren…………..………………………… 26 4.1.4 Bis-(tertbutyl-carbamoylhydrazido)-DTPA-Ligand und Gd(III)- Komplex…………………………..………………………………….. 27 4.1.5 Bis-(Hydrazido)-DTPA-Gd(III)-Komplex…………………............. 28 4.1.6 T1-Relaxationszeiten von Bis-Hydrazid-DTPA-Gd(III)- Komplexen.................................................................................. 28 4.1.7 NMR-Kinetik von Gd(III)-DTPA-Bishydrazid-Komplexen………. 30 4.2 Polyfluorierte Bis-benzyl-DTPA-Gd(III)-Komplexe……………………… 33 4.2.1 Bis-(4-fluorbenzylamido)-DTPA-Gd(III)-Komplex…………….…. 33 4.2.2 Bis-(3,5-trifluormethylbenzylamido)-DTPA-Gd(III)-Komplex…… 33 4.2.3 Bis-(3,5-trifluormethylbenzyl)-DTPA-diester Gd-Komplexes…… 34 4.2.4 1 H- und 19F-T1-Zeit-Messungen der polyfluorierten GdKomplexe…………………………………………………………….. 35 4.2.5 Temperatureffekte des 19F-NMR-Signals von fluorierten DTPAKomplexen………………………………………………..……….… 37 4.3 Allgemeine Synthese von Bis-Steroid-DTPA- und TTHA-diesterGd(III)-Komplexen………………………………………………………... 38 4.4 Bestimmung der T1-Zeiten von Steroid-TTHA-diester-Gd(III)- Komplexen………………………………………………………………..... 41 4.5 MR-Experimente an C6-Zellen mit Bis-Steroid-TTHA-Gd(III)- Komplexen. …………………………………………………………………. 44 5.0 Synthese von Bis-Phosphatidylethanolamido(DPPE)-DTPA-Gd(III)- Komplex und Bis-(DPPE)-TTHA-Ligand…………………………………….. 45 6.0 Synthese des Bis-Normorphinamido-DTPA-Gd(III)-Komplex…………... 47 6.1 T1-, T2-Relaxationzeiten des Bis-Normorphinamido-DTPA-Gd(III)- Komplex………………...…………………………………………………... 47 6.2 Zerfall des Bis-Normorphinamido-DTPA-Gd(III)-Komplexes in Zellkulturmedium….……….………………………………………………. 49 6.3 MR-Experimente an C6-Zellen inkubiert mit Bis-(Normorphinamido)- DTPA-Gd(III)-Komplex…………………………………..………………... 50 7.0 Synthese von Ligandensystemen, die auf Cyclen basieren (DO3A, DOTA)……………………………………………………………………………... 52 Inhaltsübersicht XI 7.1 Umsetzung von DOTA-Me-Glycinamid mit 3,5-BisTrifluormethylbenzylamin………………………..………………………… 53 7.2 Umsetzung von DOTA-Me-Glycinamid mit Normorphin…………..…... 53 7.3 Umsetzung von DOTA-Methyl-Glycinamids mit DPPE……..…………. 54 7.4 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-tris-essigsäure-tert-butylester (DO3A). …………………………………………………........................... 54 7.5 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-tris-essigsäure-tert-butylester- 10-ethylalkohols.................................................................................... 55 7.6 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-tris-essigsäure-tert-butylester- 10-essigsäuremethylesters................................................................... 56 7.7 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-tris-essigsäure-tert-butylester- 10-essigsäure-tert-butylcarbamoylhydrazids (DOTA-Hydra-Boc)…..... 56 8.0 Zusammenfassung und Ausblick……….…………………………………… 59 9.0 Experimenteller Teil…………………………………………………………….. 66 9.1 Darstellung von DTPA-Bisanhydrid………………………..…………… 66 9.2 Darstellung von TTHA-Bisanhydrid…………………………………….. 66 9.3 Allgemeine Synthese von Bis-Hydrazid-DTPA-Liganden……………. 67 9.4 Allgemeine Synthese von Bis-Hydrazid-DTPA-Gd-Komplexen……... 67 9.5 Bis-Phenylhydrazid-DTPA-Ligand und Gd(III)-Komplex…………...… 68 9.6 Bis-(2,4)-Dinitro-phenylhydrazido-DTPA-Liganden und Gd(III)- Komplex.............................……………………………………………… 69 9.7 Bis-tert-butylcarbamoylhydrazido-DTPA-Ligand und Gd(III)- Komplex........……………………………………………………………… 70 9.8 Bis-hydrazido-DTPA-Gd-Komplex……………………………………… 71 9.9 Allgemeine Synthese von fluorierten bzw. trifluormethylierten Benzyl-DTPA-diester bzw. bisamid-Liganden..................................... 71 9.10 Allgemeine Synthese von fluorierten bzw. trifluormethylierten Benzyl-DTPA-diester bzw. bisamid-Komplexen................................. 72 9.11 Bis-(4-Fluorbenzylamido)-DTPA-Liganden und Gd-Komplex……….. 72 Inhaltsübersicht XII 9.12 Bis-(3,5-Bis-Trifluormethylbenzylamido)-DTPA-Ligand und GdKomplex…………………………………………………………………… 73 9.13 Bis-(3,5-Bis-Trifluormethylbenzyl)-DTPA-diester-Liganden………….. 74 9.14 Synthese vom Bis-(3,5-Bis-Trifluormethylbenzyl)-DTPA-diester-GdKomplex.............................................................................................. 75 9.15 Allgemeine Synthese von steroidsubstituierten DTPA-diesterLiganden…………………………………………………………………… 75 9.16 Bis-(11,17,21-trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-21)-DTPA-diester [Bis-Cortisol-DTPA-diester]……………………………………………… 76 9.17 Bis-(11,21-dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion-21)-DTPA-diester [BisCorticosteron-DTPA-diester]…………………………………………….. 77 9.18 Bis-(9-Fluor-16-methyl-11,17,21-trihydroxy-3,20-pregnandion- 21)-DTPA-diester [Bis-Dexamethason-DTPA-diester]……………….. 78 9.19 Bis-(17,21-dihydroxy-4-pregnen-3,11,20-trion-21)-DTPA-diester [Bis-Cortison-DTPA-diester]…………………………………………….. 79 9.20 Bis-(5-Androstan-3-ol-17-on-3)-DTPA-diester [Bis-AndrosteronDTPA-diester]…………………………………………………………….. 80 9.21 Bis-(3-Hydroxy-5-Cholan-24-carbonsäure-3)-DTPA-diester [BisLithocholsäure-DTPA-diester]…..………………………………………. 81 9.22 Bis-(5-Cholesten-3)-DTPA-diester [Bis-Cholesterin-DTPA-diester].. 82 9.23 Allgemeine Synthese von Steroid-DTPA-Gd(III)-diester Komplexen.. 83 9.24 Bis-(5-Cholesten-3)-DTPA-diester-Gd(III)-Komplexes [BisCholesterin-DTPA-diester-Gd]………………………………………….. 83 9.25 Bis-(11,17,21-trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-21)-DTPA-diesteGd(III)-Komplexes [Bis-Cortisol-DTPA-diester-Gd]............................. 83 9.26 Bis-(17,21-dihydroxy-4-pregnen-3,11,20-trion-21)-DTPA-diesterGd(III)-Komplexes [Bis-Cortison-DTPA-diester-Gd]........................... 84 9.27 Bis-(3-Hydroxy-5-Cholan-24-carbonsäure-3)-DTPA-diesterGd(III)-Komplexes [Bis-Lithocholsäure-DTPA-diester-Gd]................. 84 9.28 Bis-(5-Androstan-3-ol-17-on-3)-DTPA-diester-Gd(III)-Komplexes [Bis-Androsteron-DTPA-diester-Gd]……………………………………. 84 Inhaltsübersicht XIV 9.29 Bis-(9-Fluor-16-methyl-11,17,21-trihydroxy-3,20-pregnandion- 21)-DTPA-diester-Gd(III)-Komplexes [Bis-Dexamethason-DTPAdiester-Gd].......................................................................................... 85 9.30 Bis-(11,21-dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion-21)-DTPA-diesterGd(III)-Komplexes [Bis-Corticosteron-DTPA-diester-Gd]................... 85 9.31 Allgemeine Synthese von Bis-Steroid-TTHA-Liganden……………… 85 9.32 Bis-(9-Fluor-16-methyl-11,17,21-trihydroxy-3,20-pregnandion- 21)-TTHA-diester [Bis-(Dexamethason)-TTHA-diester]……………… 86 9.33 Bis-(17,21-dihydroxy-4-pregnen-3,11,20-trion-21)-TTHA-diester [Bis-Cortison-TTHA-diester]……………………………………………... 87 9.34 Bis-(17,21-dihydroxy-1,4-pregnadien-3,11,20-trion-21)-TTHAdiester [Bis-Prednison-TTHA-diester]………………..………………… 88 9.35 Bis-(11,17,21-trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-21)-TTHA-diester [Bis-Cortisol-TTHA-diester]……………………………………………… 89 9.36 Allgemeine von Steroid-TTHA-Gd(III)-diester Komplexen…………… 90 9.37 Bis-(9-Fluor-16-methyl-11,17,21-trihydroxy-3,20-pregnandion- 21)-TTHA-diester-Gd(III)-Komplex [Bis-Dexamethason-TTHAdiester-Gd]………………………………………………………………… 90 9.38 Bis-(17,21-dihydroxy-1,4-pregnadien-3,11,20-trion-21)-TTHAdiester-Gd(III)-Komplex [Bis-Prednison-TTHA-diester-Gd]………….. 91 9.39 Bis-(11,17,21-trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-21)-TTHA-diesterGd(III)-Komplex [Bis-Cortisol-TTHA-diester-Gd-Komplex]…………... 91 9.40 Bis-(17,21-dihydroxy-4-pregnen-3,11,20-trion-21)-TTHA-diesterGd(III)-Komplex [Bis-Cortison-TTHA-diester-Gd]…………………….. 92 9.41 Synthese des Bis-(Dipalmitoylphosphatidylethanolamido)-DTPALiganden. ………………………………………………………………… 92 9.42 Synthese des Bis-(Dipalmitoylphosphatidylethanolamido)-DTPAGd(III)-Komplexes………………………………………………………… 94 9.43 Synthese des Bis-(Dipalmitoylphosphatidylethanolamido)-TTHALigand….…………………………………………………………………... 94 9.44 Synthese des Bis-Normorphin-DTPA-bisamids……………………….. 96 9.45 Synthese des Bis-Normorphin-DTPA-bisamid-Gd-Komplexes……… 97 Inhaltsübersicht XIV 9.46 Synthese von -Cholesterylhydrazin…………………………………… 97 9.47 Synthese des 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N´,N´´-trisessigsäure-tert-butylester (DO3A)...................................................... 98 9.48 Synthese des 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N´,N´´,-trisessigäure-tert-butylester-N´´´-essigsäuremethylester (DOTA-OMe).. 99 9.49 Synthese von N-Tert-butyl-carbamoyl-N´-Bromacetylbishydrazid….. 100 9.50 Synthese des 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N´,N´´-trisessigsäure-tert-butylester-N´´´-essigsäure-tertbutylcarbamoyldihydrazid (DOTA-Boc-hydrazid)……………………... 101 9.51 Synthese des 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,-trisessigsäure- 10-essigsäurehydrazids………………………………………………….. 102 9.52 Synthese des 1,4,7,10-Tetraazacyclododekan-N,N´,N´´,-trisessigsäure-tert-butylester-N-ethylalkohol…………………………...…. 103 9.53 Synthese des Essigsäure-2-iodethylester........................................... 104 9.54 Synthese des 1,4,7,10-Tetraazacyclododekan-N,N´,N´´,-trisessigsäure-tert-butylester-N-ethylessigester………………………….. 104 10.0 Literatur…………………………………………………………………………… 106 Verwendete Abkürzungen…………………………………………………………….. I Tabellen- und Abbildungsverzeichnis………………………………………………. III Geräteliste………………………………………………………………………………... VI Danksagung…………………………………………………………………………....... VIII Lebenslauf……………………………………………………………………………….. X Erklärung………………………………………………………………………………..... XI Einleitung 1 1.1 Einleitung: Als Magnet Resonanz Tomographie (MRT) bezeichnet man Kernspin-ResonanzUntersuchungen am Menschen, wobei der Begriff Tomographie aus den griechischen Wörtern „tomos“ Schicht und „graphein“ Schreiben zusammengesetzt ist. Die Magnet-Resonanz-Bildgebung wurde durch die Arbeiten von Lauterbur et al. [1] erstmals beschrieben. Dieses bildgebende Verfahren basiert auf der Messung eines ortsabhängigen NMRSignals. Die magnetischen Momente von NMR-aktiven Kernen werden mittels ortskodierter Gradientenfelder lokalisiert. Da Wasser in lebenden Organismen den größten prozentualen Anteil ausmacht, ist es sinnvoll das Protonensignal des Wassers zu messen. Andere NMR-aktive Kerne wie 13C, 31P und 19F können ebenfalls gemessen werden, spielen aber im im Vergleich zu wasserbildgebenden Verfahren eine untergeordnete Rolle. Die Signalintensität und somit das Signal/Rausch-Verhältnis hängen von der Konzentration des beobachteten Kerns (Spindichte), der Feldstärke des äußeren Magnetfeldes, der natürlichen Häufigkeit des zu beobachtenden NMR-aktiven Kerns und vom gyromagnetischen Verhältnis des betreffenden Kerns ab. Im lebenden Organismus ist Wasser unterschiedlich stark verteilt. In den Knochen oder im Fettgewebe liegt weniger Wasser vor als im Blut oder in der Blase. Das erzeugte Abbild gibt diesen Zusammenhang wieder und zeigt die einzelnen Gewebetypen unterschiedlich stark hervorgehoben. Das ortsabhängige Wassersignal bzw. die Signalintensität wird von Relaxationsprozessen (T1- bzw. T2-Relaxation) beeinflusst und ist nach Anregung zeitabhängig. Die chemische Umgebung (Fette, Proteine etc.) und die physikalische Umgebung (Temperatur, Diffusion etc.) des beobachteten Wassers beeinflusst die Relaxationszeiten der einzelnen Regionen, was für die Bildgebung genutzt wird. Die Relaxationzeit des Wassers in der Umgebung eines paramagnetischen Kontrastmittels ist stark verkürzt. Koordinative Relaxationsagentien enthalten mindestens ein paramagnetisches Zentralion, wobei der Paramagnetismus mit der Anzahl an paramagnetischen Ionen ansteigt und in wässriger Lösung die Relaxationszeit stärker verkürzt wird. Die Wirkung dieser Kontrastmittel in einer T1-gewichteten Bildgebung beruht auf einer koordinativen Wechselwirkung der umgebenden Wassermoleküle mit dem paramagnetischen Zentralion. Der paramagntische Komplex liegt in Lösung Einleitung 2 solvatisiert vor. Die Solvathülle wird in zwei Bereiche, die innere und äußere Solvatationssphäre unterteilt. Die direkte koordinative Wechselwirkung des Wassermoleküls ist keinesfalls starr, sondern dynamisch. Ein Austausch von Wassermolekülen der inneren Solvatationssphere mit der äußeren Sphere findet in Lösung ständig statt. Die Austauschzeiten der Wassermoleküle zwischen innerer und äußerer Sphere betragen wenige ps[2]. Die Metallionen der Übergangsmetalle, Lanthaniden und Actiniden besitzen ungepaarte Elektronen in den Valenzorbitalen, was ein großes magnetisches Moment zur Folge hat. Eine Einfachbesetzung aller d-Orbitale bzw. f-Orbitale führt zu einem magnetischen Moment. Die Elektronenkonfiguration des Zentralions als auch die Koordinationszahl des verwendeten Liganden beeinflussen die Art des beobachteten Kontrastes (T1- bzw. T2-). Metallionen mit einzelnen doppeltbesetzten d- bzw. f-Orbitalen führen zu einer verstärkten T2-Relaxation des untersuchten Kerns. Die magnetischen Momente der Wasserstoffatome im Wassermolekül werden durch eine dipolare Wechselwirkung zwischen den magnetischen Momenten der ungepaarten Elektronen der Metallionen beeinflusst, wodurch eine Abnahme der Signalintensität des Protonensignals des Wassers in Umgebung des paramagnetischen Kontrastmittels zu beobachten ist. Die T1-Zeit des Wassersignals einer wässrigen Lösung eines Kontrastmittels ist Konzentrations- und Feldstärkenabhängig. Verallgemeinert lässt sich sagen, je größer die Konzentration an Kontrastmittel ist, desto kürzer ist die T1-Zeit des Wassers. Mit steigender Konzentration an Kontrastmittel in einer wässrigen Lösung nimmt ebenfalls die T2*- Zeit ab, was eine Linienverbreiterung der Signale bewirkt. Die freien zwei- bzw. dreiwertigen Ionen der Übergangsmetalle [Mn, Fe][3] und Lanthanoide [Dy, Gd] sind toxisch, was für eine Anwendung als MR-Kontrastmittel eine thermodynamisch und kinetisch stabile Komplexierung durch Chelat-Liganden erforderlich macht. Im Juni 1988 wurde Magnevist® (Abb. 1) der Schering AG, als erstes T1-MR-Kontrastmittelchelatkomplex für die Anwendung zugelassen. Der Ligand des Magnevist® ist DTPA (Dieethylentriaminpentaacetat), ein Polyaminocarboxylatsystem. Der Gd-Komplex des DTPA zeichnet sich in der Transmetallierungsreaktion gegenüber Zink-(II)-Ionen durch eine relativ hohe thermodynamische und kinetische Komplexstabilität aus. Das Konkurrenzprodukt Omniscan® (Abb. 1) der Firma Bracco Ltd. auch Gadolinium-DTPA-BMA (Diethylentriaminpentaessigsäure-bis-dimethylamid) genannt, besitzt im Vergleich Einleitung 3 zum Gd-DTPA eine geringfügig größere Komplexstabilität [7]. Eine Freisetzung von Gd3+-Ionen im menschlichen Körper war bei niedrigen Verweilzeiten im menschlichen Körper nicht zu erwarten. Neuere Arbeiten belegen, dass bei Patienten mit akuter Niereninsuffizienz, das Kontrastmittel länger im Körper verbleibt und es zu schwerwiegenden Gd-Intoxikationen kommen kann [4]. N N N O O O O O O O O O O Gd3+ N N N O O O N O O N O O O Gd3+ CH3 CH3 CH3 H3C N N N O O O O O O Gd3+ N O O N N N O O O O O O O O O O Gd3+ O HO P O 2- 0 Gd(III)-DTPA Gd-DTPA-BMA - Gd-DOTA Abb. 1: Strukturen von zugelassen MR-Kontrastmitteln (von rechts nach links Magnevist®, Omniscan®, Dotarem®, MS-325®) Gadolinium, in ungebundener ionisierter Form, ist stark neurotoxisch und interagiert irreversibel an Calcium-Ionen–Kanälen (Niere/Leber/Gehirn) [5, 6, 7]. Nach Gabe dieser Kontrastmittelkomplexe bleiben diese aufgrund ihrer hydrophilen Eigenschaften im Gefäßsystem und sind keinesfalls in der Lage die Blut-HirnSchranke zu überwinden. Nach Injektion des Kontrastmittels steht ein definiertes Zeitintervall zur Verfügung, da die erwähnten Diagnostika schnell unverändert über die Nieren ausgeschieden werden (Beim Magnevist beträgt die Plasmahalbwertszeit 1,5h) [8]. Die spezifischen medizinischen diagnostischen Fragestellungen erfordern den Einsatz von selektiveren Kontrastmitteln, was eine entsprechende chemische Funktionalisierung der paramagnetischen MR-Kontrastmittel mit Biomelekülen nahe legt, um molekulare rezeptorvermittelte Prozesse mittels MR-Bildgebung sichtbar zu machen. Diese biosensitiven Komplexe zeigen mit Hilfe der MR-Bildgebung idealerweise Ort und Quantität der Wechselwirkung in der Zelle bzw. im Körper an. Einleitung 4 Die folgenden Verknüpfungen von Kontrastmitteln mit Biomolekülen werden zur Zeit intensiv untersucht: - Polypeptide bzw. Proteine zur Darstellung der extrazellulären Signalübertragung, bei denen die Proteine selektiv an extracellulären Rezeptoren (Somastatin) binden. (Die Aufnahme durch Zellen erfolgt soweit bekannt über Exocytose - Moleküle (chemische Sonden), mit denen chemische oder physikalische Parameter bestimmt werden können (Glucose-Konzentration, pH-Wert, Calcium-Konzentration, Temperatur) - Lipophile Seitengruppen, die an Zellmembranen und Vesikeln von Zellen (Fettsäuren, Phospholipide) binden - Chemisch modifizierte Liposome, die mit Kontrastmitteln beladen sind Bei der Synthese wird der verwendete Chelatligand mit dem biologisch aktiven Molekül verknüpft, dann entschützt und anschließend mit Gadolinium in wässriger Phase komplexiert. Das verknüpfte Molekül enthält häufig selbst koordinationsfähige Gruppen, die mit dem Gadolinium wechselwirken können. Im ungünstigen Fall wird Gadolinium außerhalb des Chelat-Liganden labil gebunden und kann in späteren Experimenten das zelltoxische Gd3+-Ion freisetzen. Ein dazu alternatives Konzept „pre loading concept“ kehrt die Reaktionsreihenfolge um, wobei zunächst die Komplexierungsreaktion von Chelat-Ligand und Gadolinium durchgeführt und nach Abtrennung und Reinigung das biologisch aktive Molekül an den Gd-Komplex gebunden wird. Nach der Komplexbindung ist das biologisch aktive Molekül in seiner Beweglichkeit eingeschränkt (sterische Einflüsse, Zunahme des Molekulargewichts), was oft die Bindungsfähigkeit zum molekularen Ziel „Target“ verringert. Für bildgebende MR-Experimente an Zellen ist eine hohe Konzentration an bioaktiven Komplexen und deren Zielstrukturen „Targets“ wünschenswert. Befinden sich zum Beispiel an der Zelloberfläche (Taget) nur wenige Rezeptoren, so ist eine Bindung des Kontrasmittels zur Zielstruktur möglich, jedoch kann diese nicht beobachtet werden. Aus diesem Grund wurden sehr viel effektivere Kontrastmittel mit mehrkernigen Gadolinium-Chelatkomplexen oder Eisenoxidpartikeln (PIO´s) entwickelt [9, 10]. Einleitung 5 Eine physikalische Größe für die Effektivität eines Kontrastmittels ist die Relaxivität (1/T1) des Wassers bezogen auf die Konzentration an Kontrastmittel (1 mmol/l). Eine Übersicht zeigt den Stand der Entwicklung Ende 2007: Gadolinium-DOTA- modifiziert mit einem Steroidhormon (RU486) 1, welches an Progesteronrezeptoren interagiert - Meade et al. [11]. N N N N Gd3+ O O O O O O O O N H S N H O N N H H OH 1 DOTA-Gd-Komplex mit zwei Zuckereineinheiten 2 mit - Andre et al. [12]. OAc OAc OH O AcO N H N N H O N O S O S OAc OAc OH O AcO N H N N N N O O O O O O Gd3+ O 2 111In3+-DOTA- mit Somatostatin-Rezeptor-bindenden Polypeptid 3, der in vivo an Tumorzellen der Ratte binden konnte - Antunes et al. [13]. N N N N O O O O O O O X N H O N H N H O O N H NH HN O NH2 N H O HO O N H S S O N H HO HO 3 Einleitung 6 Dimerer DO3A-Gd(III)-Komplex mit DTPA-Einheit 4 als ein Ca2+ bzw. Zn2+-sensitives Kontrastmittel - Mishra et al. [14]. N N N N O O O O O O Gd3+ N H O N OH O N N N H O O HO O HO N N N N O O O O O O Gd3+ 4 DO3A-Gd(III)- mit einer FITC-Fluoreszenzgruppe 5, das die Zellmembran durchdringt - Mishra et al. [15]. O N N N N O O O O O O Gd3+ N H S N H O HO OH O 5 DO3A-Gd p-Nitrophenol 6, macht pH-Werte in Titrationen zugänglich - Woods et al. [16]. N N N N OH O2N O O O O O O Gd3+ 6 MS-325®ein seit 2006 zugelassenes lipophiles Kontrastmittel 7 für die Leberbildgebung [17]. N N N O O O O O O Gd3+ O O O O O HO P O 7 Einleitung 7 Ein liposomales MRI Kontrasmittel 8, das ein Phospholipid(DPPE)-Molekül enthält und Micellen ausbilden kann - Grant et al. [18 N N N N H O O O O O O P O O O O O C15H31 O C15H31 HO O Gd3+ O O O 8 Gd-DTPA-Kontrastmittel 9, die mit Phosphorlipidmicellenmembranen wechselwirken können - Parac-Vogt et al. [19 N O N H O O N N H O N O O O O Gd3+ O O O O R R C14H29 C16H33 C18H37 Tetradecyl R= Hexadecyl Octadecyl 9 DOTA-Gd(III)- Polyarginin 10 markiert 3T3-Zellen und wird in das Cytosol transportiert- Allen et al. [20, 21]. N H HN NH H2N N H O O N N N N O -O O -O -O O O OH Gd3+ NH H2N NH 10 DOTA-Gd- Galactose 11 detektiert die Genexpression in Xenopopus laevis In vivo - Louie et al. [22]. OR OH O O OH N N N N O -O O -O -O O Gd3+ H3C OH 11 Einleitung 8 Vierkerniger Gadolinium-(III)-DO3A-Komplex 12 - Jebasingh et al. [9] N N N N N N N N N N N N N N N N O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O Gd3+ Gd3+ Gd3+ Gd3+ 12 Die gezeigten Moleküle enthalten als Chelat-Liganden meist das DOTA-System (1,4,7,10-Tetraazacyclododekan-N,N´,N´´,N´´´-tetraessigsäure bzw. DO3A-System (1,4,7,10-Tetraazacyclododekan-N,N´,N´´-triessigsäure) mit Gadolinium als Zentralion. Diese Liganden liefern thermodynamisch und kinetisch stabilere und damit weniger toxische Komplexe als die offenkettige DTPA-Struktur. Durch Funktionalisierung des Liganden kann der Gd-Koplexes länger im im Organismus verweilen, was bezüglich der Stabilität hohe Anforderungen stellt. 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan und größere heterocyclische Verbindungen wurden erstmals 1954 von Stetter et al. [23, 24] beschrieben, aber erst 1976 von Stetter et al. [25] mit Chloressigsäure zum 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N´,N´´,N´´´- tetraessigsäure (DOTA) alkyliert. Weitl et al. [26] berichten über den N,N´,N´´,N´´´- Tetrakis-(2,3-Dihydroxybeozoyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-Liganden und deren Actiniden-(IV)-Komplexe im besonderen die Plutonium (IV)-Komplexe. Die effektive Komplexierung von Radionukliden durch DOTA-Liganden ist für die SPECT-Bildgebung (Single Photon Emission Computer Tomography) bzw. PETBildgebung (Positronenemissionstomographie) als auch für eine Strahlentherapie von Tumorerkrankungen von großer Bedeutung. [13, 27, 28] NMR-spektroskopische Untersuchungen an Lanthanoid DOTA-Komplexen wurden 1980 von Desreux et al. [29] durchgeführt. 1.2 Grundlagen der MR bildgebenden Verfahren (MRI)[30, 31] In MR-bildgebenden Verfahren nutzt man den überlagernden Effekt von ortsabhängigen und sich zeitlich veränderbaren Gradientenfeldern G mit dem statischen Magnetfeld B0. Die xy-Komponenten des effektiven Magnetfeldes B0 eff und somit auch die Resonanzfrequenzen werden dadurch ortsabhängig. Die Lokalisation Einleitung 9 des entsprechenden Signals hängt somit von der Schaltung der Gradienten ab. Wirkt das Gradientenfeld während einer frequenzselektiven Anregung (mittels eines frequenzselektiven HF-Pulses), so wird nur eine definierte Schicht, die senkrecht zum Gradientenfeld steht, angeregt. Die Schaltung eines Gradienten während der Signalaquisition (Frequenzkodierung), führt zu Spins mit ortsabhängig definierten Resonanzfrequenzen, die in Gradientenrichtung detektiert werden. Eine ortsabhängige Phaseninformation der Spins kann bei Schaltung des Gradientenfeldes G zwischen Anregungspuls und Aquisition erreicht werden (Phasenkodierung). Die gemessene NMR-Signalintensität hängt von verschiedenen physikalischen Größen ab, i.e. Spin-Dichte , longitudinale Relaxationszeit T1, transversale Relaxationszeit T2, effektive tranversale Relaxationszeit T2 * und Temperatur T u.a.m. Diese signalintensitätsbestimmenden Größen können vielfältig zur diagnostischen Bildgebung (Kontrastierung) genutzt und ortsabhängig bestimmt werden, wobei das nichtinvasive Messverfahren und die nicht vorhandene Strahlenbelastung die eigentlichen Vorteile der MRI ausmachen. 1.3 Zellmarkierungsansätze von Kontrastmitteln In den folgenden Abschnitten wird auf die in dieser Arbeit verwendeten Verbindungen eingegangen. Die besonderen Eigenschaften sind für spätere Zellmarkierungsexperimente essentiell. 1.4 Phospholipide und Zellmembranen Die Zellmembran besteht zu einem sehr hohen Anteil aus lipophilen Bestandteilen wie Phospholipiden und Cholesterin, welche sich in Lösung spontan zu einer Lipiddoppelschicht organisieren können. Phospholipide enthalten eine hydrophile polare Kopfgruppe (Phosphoethanolamin, Phosphoinostol, Phosphoserin, Phosphocholin etc.) und mindestens eine lipophile Seitengruppe (Fettsäuren mit einer C-Atomanzahl zwischen 14 und 24) und werden in Phosphoglyceride, Sphingomyeline und Glycolipide unterteilt. Die ausgebildete Doppelschicht (Abb. 2) stellt eine Barriere für polare Substanzen und Ionen dar. Viele Proteine befinden sich in der Zellmembran, die an unterschiedlichsten Signaltransduktionsprozessen und Transportprozessen durch die Membran (Ionenkanäle, Substratcarrier etc.) beteiligt sind. Unter den Phospholipiden Einleitung 10 stellen Dipalmitoylphostatidylethanolamin (DPPE) und Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) die Hauptbestandteile der Zellmembran dar. O P O O O OH O NH2 O O O P O O O OH O N+ O O O P O O O OH O NH2 O O COOH Dipalmitoylphosphatidylethanolamin Dipalmitoylphosphatidylcholin Dipalmitoylphosphatidylserin Abb.2Phospholipidstrukturen und der schematische Aufbau einer LipidDoppelschicht[91] Die Selbstorganisation zur Lipiddoppelschicht ist auf Dispersionskräfte zwischen den Alkylseitenketten zurückzuführen, wobei die polaren Reste in den intra- und extrazellulären Raum zeigen. Phosphorlipide werden als Transportsysteme (Vesikel) zum markieren von Zellen bereits genutzt. Gd-Kontrastmittel oder Eisenoxidpartikel[34] (PIO), welche allein nicht in der Lage sind in die Zelle zu gelangen, werden zu einer wässrigen Suspension von Phospholipiden gegeben und mittels einer thermischen und einer Ultraschallbehandlung in beladene Vesikel überführt. Die mono-Verknüpfung an der zentralen Carboxy-Gruppe des DTPA mit einem Phospholipid (DPPE) wurde von Grant et al. [18] bereits beschrieben. Dieses monosubstituierte Phosphotidylamido-DTPA-Ligandensystem wurde mit Gadolinium- (III)-trichlorid zum Gd-DTPA-Komplex umgesetzt. Die in dieser Arbeit aufgeführte Auftragung der Relaxivitäten zur jeweiligen Konzentration des MonoDipalmitylphosphatidylamido-DTPA-Gd(III)-Komplexes in Wasser zeigt keinen linearen Anstieg, was auf Micellenbildung hindeutet. Die Ausbildung von Micellen konnte mittels elektronenmiskroskopischer Aufnahmen bestätigt werden. Parac-Vogt et al. [19] berichten 2006 über die Synthese einer Gd-DTPA-bisamidKontrastmittelsubstanzklasse (siehe Einleitung Verbindung 9), welche in DPPC- Einleitung 11 Micellenmembranen einlagern kann. Die Micellengrößen wurden mittels eines LaserScattering-Microscop bestimmt und statistisch ausgewertet. Micellenbildende DOTAGd(III)-Komplexe sind in dem Patent von Cockbrain et al. [97] beschrieben. 1.5 Steroide Steroide spielen in der belebten Natur eine wesentliche Rolle, so ist beispielsweise das Cholesterin als ein wesentlicher Bestandteil von Zellmembranen und als Ausgangssubstanz essentiell für die Biosynthese aller Steroidhormone (Gestagene, Androgene, Glucocorticoide, Mineralocorticoide, Östrogene) und Gallensäuren[61, 91]. Alle zuvor genannten Steroidklassen mit Ausnahme der Gallensäuren sind Botenstoffe in den vielfältigsten Bereichen. Glucocorticoide fördern die Gluconeogenese und den Glycogenaufbau und regulieren den Fettsäure- bzw. Proteinabbau [34]. Zunächst soll hier auf die Corticoide eingegangen werden. Das in Abb. 3 mit Struktur dargestellte Hydrocortison (Cortisol) wird in der Nebenniere erzeugt, und spielt eine Rolle als Botenstoff bei Entzündungsprozessen und Stress. O OH O OH OH H H H 2 3 4 1 10 5 6 7 9 8 12 11 13 14 15 16 17 O 18 19 O H H H OH OH HO A B C D Abb. 3 Konformation und Nummerierung des Hydrocortisons O O O OH OH H H H O O O OH OH H H H O HO O OH OH H H H O HO O OH H H H O HO O OH F H H OH HO H H H HO H H H OH O H HO H H HO H H H O Prednison Cortison Hydrocortison(Cortisol) Corticosteron Dexamethason verwendete Corticoide Andere verwendete Steroide Cholesterin Lithocholsäure Ergosterin Androsteron Abb.4 Strukturen der verwendeten Steroide Einleitung 12 Die in Abb. 4 gezeigten Strukturen wurden zur Funktionalisierung der DTPA- bzw. TTHA-Liganden eingesetzt. Bei einem Vergleich der Strukturen ist zu erkennen, dass bei den Glucocorticoiden immer das gleiche Grundfragment vorhanden ist. Sie bestehen aus einem Steranringsystem, das in Position 3 eine Carbonyl-Gruppe trägt. Die Anzahl der Doppelbindungen im Ring A variiert, während die Hydroxy-CarbonylEinheit gebunden an C17 immer vorhanden ist. Die tertiäre OH-Gruppe in PositionC17 ist für eine Rezeptorbindung nicht zwingend notwendig. Zwei ähnliche molekulare Corticoid-Rezeptoren werden dabei unterschieden, der Corticoid-Typ-Isowie der Mineralocorticoid-Typ-I-Rezeptor. Die Bindungsaffinität und auch Bindungsspezifität zum Mineralo- bzw. Glucocorticoid-Rezeptor hängt von der Hydroxygruppe in Position C10 bzw. C17 und der Anzahl der Doppelbindungen in Ring A ab. Im Corticoid Dexamethason ist in C9- Position ein Fluoratom eingeführt worden und in Position C16 befindet sich eine Methylgruppe. Corticoide werden medizinisch bei Autoimmunkrankheiten (Asthma, Neurodermitis, Psoriasis, Allergien) eingesetzt. Nach einer Bindung eines Corticoids an einen Mineralocorticoid-Rezeptor (MR) wird der K+ -Ionen Haushalt in C6-Zellen beeinflusst [34-36]. Nach de Kloet et al. [36] findet die Überwindung der Blut-HirnSchranke über Endothelzellen statt, die das Multidrug-resisstance-P-Glycoprotein mdr-PGP) besitzen, was anhand von Tritium markierten Dexamethason nachgewiesen werden konnte. In der im Jahr 2007 erschienenen Arbeit von PiwienPilipuk et al. [38] wird berichtet, dass sich der MR-Rezeptor nicht in der Zellmembran befindet, sondern im Cytoplasma und nach Bindung des Agonisten sehr schnell in den Zellkern gelangt. In den Arbeiten von Kumar et al. [39, 40] wird der Einfluss von Corticoiden auf C6 Zellen beschrieben. In Proteinessays wurde dabei eine eindeutige Überexprimierung der Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase festgestellt. 1.6 Hydrazin-Substrate Die Darstellung von DTPA-bisamid-Komplexen und DTPA-Diester-Komplexen ist in der Literatur im Gegensatz zu Hydrazid-Ligandensystemen hinreichend beschrieben. Die Hydrazid-Bindung ist von der Hydrolysestabilität vergleichbar mit der von Säureamiden und kann nur im stark Sauren gespalten werden. Ein zugelassenes Kontrastmittel ist das Gadophrin® der Schering AG. Bei diesem Kontrastmittel sind zwei DTPA-Mono-hydrazid-Einheiten mit einer Porphyrin-Einheit verknüpft [41]. Einleitung 13 NH NH O N N N O O O O O O O O Gd3+ HN HN O N N N O O O O O O O O Gd3+ N HN N N H O O Abb. 5 Struktur des Gadophrins®[41] Die Möglichkeit der Verknüpfung von Biomolekülen an Ligandensysteme mittels einer Hydrazid-Bindung ist somit möglich. Biologisch aktive Hydrazin-Verbindungen, wie die Substanzklassen der Hydrazinopyridazine (Prizidilol, Hydralazin) und Nikotinsäurealkylhydrazide besitzen pharmakologische Eigenschaften, die therapeutisch genutzt werden bzw. wurden. N N H O N H N N NH H2N Iproniazid Hydralazin Abb. 6 Strukturen pharmakologisch aktiver Hydrazinverbindungen Iproniazid (Abb. 6) ist ein Monoaminooxigenase-(MAO)-Inhibitor und wurde bei Depressionen eingesetzt. Hydralazin wird bei akuter Hypertonie eingesetzt, wobei die Wirkungsweise noch weitgehend unbekannt ist. Burton-Pye et al. [43] berichten 2005 über ein Hydralazin-Derrivat, welches an ein DO3A-Ringsystem verknüpft wurde (Abb. 7). Folgend wurden Lanthanoid(III)-Komplexe dargestellt und deren Fluoreszenzeigenschaften untersucht. N N N N O O O O O O N N N N Eu3+ [42] N H N H OO MeO OMe OMe NH NH NH HN O N O N N N O O O O O O O O Gd3+ N N O O O O O O O O Gd3+ [43] Abb. 7 Struktur von Hydrazid-Lanthanoid Komplexen Einleitung 14 T. N. Parac-Vogt et al. [43] berichten über einen zweikernigen verbrückten DTPAGd(III)-Komplex der mittels Hydrazid-Bidungen an ein symmetrisches Trägermolekül verknüpft wurde (Abb. 7). Dieser mehrkernige Gd(III)-Komplex besitzt eine große Wasseraustauschrate und eine hohe Relaxivität. 1.7 Polyfluorierte und polytrifluormethylierte Verbindungen Der paramagnetische Einfluss von Lanthanoid-Komplexen auf NMR-aktive Kerne wie 19F, 31P mit großem gyromagnetischem Verhältnis ist nach Literaturrecherchen bisher selten beschrieben. Relaxationsuntersuchungen an, mit dem Isotop 17O, 2 H angereichertem Wasser (H2 17O, D2O) sind zwecks Bestimmung der Austauschraten von Inner-sphere zu outer-sphere Wassermolekülen durchgeführt worden. Gong et al. [47] berichten über den T1-verkürzenden Einfluss von Gd-DTPA (Magnevist®) auf Trifluoressigsäure, welche durch eine koordinative Wechselwirkung des Trifluoracetats zum Gd3+-Zentralion ausgelöst wird. In einem Patent von Platzek et al. [48] wird über polyfluorierte DO3A-Gd-(III)-Komplexe berichtet, welche nach einer Abstandgruppe „Spacer“ eine polyfluorierte Seitenkette tragen. Die gesamte Substanzklasse (Abb. 8 gezeigt) ist patentgeschützt. R1 kann ein Wasserstoff sein, eine lineare oder verzweigte Alkylseitenkette C1-C10 oder eine Hydroxy- bzw. Polyhydroxyalkylkette R2 entspricht CH2-CH(OH)-CF3, CH2- C(OH)(CH3)-CF3, CH2-CH(OH)-C(CF3)3, CH2-CH(OH)-CH2-OC(CF3)3 M entspricht einem dreiwertigen Ion mit den Ordnungszahlen 21-29, 42, 44 oder 57-83 Abb. 8 Polyfluorierte DO3A-Alkyl-Derrivate für die 19F-Tomographie[47] 1.8 Neurotransmitter Die Signaltransduktion (Reizleitung) findet zwischen den einzelnen Neuronen im Gehirn über Botenstoffe die sog. Neurotransmitter im synaptischen Spalt statt. Die Synapse ist die Verbindungsstelle zwischen zwei Neuronen. Jedes Neuron besitzt durchschnittlich 3-4 Synapsen und ist demzufolge mit drei bzw. 4 weiteren Neuronen verbunden. Im Gehirn sind ca. 1011 Nervenzellen vorhanden. Dies verdeutlicht die N N N N O O O O O O n OH R1 R1 R1 R2 M Einleitung 15 Dimension eines sehr komplexen Systems, das durch Botenstoffe und Rezeptoren gesteuert wird. Bestimmte Neurotransmitter übernehmen dabei spezifische Aufgaben der Reizleitung an bestimmten Rezeptoren. Die Neurotransmitter werden in bestimmte Klassen eingeteilt. Catecholaminerge Neurotransmitter Tryptaminerge Neurotransmitter Aminosäuren bzw. Derivate Cholinerge Neurotransmitter Peptid Neurotransmitter Cannabinoide Dopamin NH2 HO OH Serotonin N H HO NH2 -Aminobutansäure O OH H2N Acetylcholin O N+ O Met-Enkephalin Tyr-Gly-Gly-Phe-Met Arachidonsäureglycinamid NH O O HO Phenylethylamin NH2 Melatonin N H N O H H3C O Glutamat O OH H2N O OH Leu-Enkephalin Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu Arachidonsäure-2- hydroxyethyl-amid NH O OH Adrenalin R=CH3 Noradrenalin R=H N H R OH HO OH N-Acetyl-aspartat O OH O OH NH O Tab. 1 Wichtige Neurotransmitter für die Signaltransduktion im Gehirn[49 ,91] Bestimmte Substanzen greifen in die Neurotransmitter Reizleitung ein (Tab. 1). Dies kann an den spezifischen Bindungsstellen (Rezeptoren), in der Biosynthese bzw. in der Ausschüttung der Neurotransmitter erfolgen. Unter den rezeptorbindenden Substanzen werden Agonisten und Antagonisten unterschieden. Äußerst effektive Agonisten mit hohen Rezeptoraffinitäten sind dabei in Pflanzen und Tieren zu finden (Alkaloide). Viele rezeptoraktive Substanzen sind exogen (z.B. Amphetamine) und kommen im lebenden Organismus nicht vor. Um die Wirkungsweise dieser Substanzen zu verstehen, ist es wichtig diese Substanzen mit den natürlichen Neurotransmittern strukturell zu vergleichen. In Tab. 2 sind natürliche und synthetische Substanzen dargestellt, die an den entsprechenden Wirkorten (Tab.1) interagieren. Die Bindungsspezifischen Strukturmerkmale sind soweit bekannt rot dargestellt. Einleitung 16 Catecholaminerge Substanzen Tryptaminartige Alkaloide GABA (I)- bzw. NMDA/Glutamat (II) Rezeptor Acetyl-CholinRezeptor Opiate Cannabinoide Mescalin NH2 O O O Lysergsäureamid NH N O H2N (I) - Hydroxybuttersäure (GHB) O OH HO Succinylcholin O N + O O OH Morphin O N HO OH H (THC) O H H OH DMMA N H O O Harmin N H N O (II) Ibotensäure H2N O N O O OH Atropin N H O O OH Phencyclidin N Cannabidiol H H OH HO Myristicin O O O Psilocybin N H N O P HO O HO (I) Muscimol H2N O N O Pethnidin N O O Cannabinol O H H OH Ephedrin N H OH Ibogain N N H O H (I) Diazepam N N O Cl Fentanyl N O O N Tab.2 Neuorotransmitter Rezeptor Agonisten mit den bindungsspezifischen Strukturfragmenten soweit bekannt in rot dargestellt[48] Im Falle der Opiat-Rezeptor-aktiven, dopaminergen und serotonergen Agonisten ist ein Strukturfragment immer wieder zu erkennen. Bei den Opiaten ist es ein in der Konformation eingeschränktes sechsgliedriges aliphatisches N-heterocyclisches System, das immer ein konformatorisch starres Phenylpropylamin bzw. Phenylethylaminfragment trägt. Die Catecholamine besitzen ebenfalls ein Phenylethylamin-Grundgerüst, das im Gegensatz zu dopaminergen Agonisten am - C-Atom bzw. -C-Atom mit einer Methyl- oder Hydroxyl-Gruppe funktionalisiert ist. Am Phenylring befinden sich häufig in 3,4,5-Position Methoxy-Gruppen, die für eine verstärkte Rezeptoraffinität sowie eine erhöhte Bioverfügbarkeit und Resorption verantwortlich sind. Der Metabolismus von Myristicin wird in der Arbeit von Beyer et al. beschrieben, wobei das Myristicin an der Doppelbindung in -Position aminiert wird und das neugebildete Dopamin(Amphetamin)-Derivat den eigentlichen Wirkstoff darstellt [27]. Diese Amphetamin-Derivate wurden mittels gaschromatographisch Einleitung 17 gekoppelter Massenspektroskopischer Messungen im menschlichen Urin nachgewiesen. In den abgebildeten serotonergen Agonisten ist immer eine Tryptamineinheit vorhanden, die meistens am Aminstickstoff alkyliert ist. In der Arbeit von Duval et al. [28] wird die Ankopplung von Naltrinidol, eines synthetischen Opiats, an die Ligandensysteme DO3A bzw. DOTA mittels verschiedener Alkylamino- bzw. Alkylaldehyd-Abstandsgruppen mit variierender Kettenlänge beschrieben. Die erhaltenen Komplexe sind in der Lage an -opioid Rezeptoren zu binden. [28] N O OH N H OH H2C N N N N O O O O O O In 111 3+ n N O OH N H OH H2C n N H N N N N O O O O O O In 111 3+ O n n Abb.9Von Duval et al. beschriebene opiatfunktionalisierte 111In-Komplexe (rechts) sowie autoradiographische Abbilder von Mäusegehirnen (links)[28] Die Komplexierung mit dem Radioisotop 111Indium verlief in der besagten Arbeit von Duval et al. erfolgreich, sodass die Verbindungen mittels Autoradiographie in vitro an Mäusegehirnen getestet wurden. In vivo Untersuchungen verliefen jedoch mangels Durchgang durch die Blut-Hirn-Schranke und des raschen Abbaus in der Leber erfolglos. Das Ergebnis der in vitro autoradiographischen Untersuchungen war eine starke Anlagerung der opiat-funktionalisierten 111In-DOTA bzw. DO3A-Komplexe in striatialen und corticalen Hirnregionen. Zudem wurde eine starke Bindung des Komplexes im Hypocampus und schwach im Hypothalamus, sowie in den Colliculi beobachtet. [28](siehe Abb.9) Aufgabenstellung 18 2.0 Aufgabenstellung: Die Darstellung neuer DTPA, TTHA und DOTA Kontrastmittel für die Markierung von Zellen ist das Ziel dieser Arbeit, wobei mit biologisch aktiven Leitstrukturen wie Steroiden, Neurotransmittern aber auch mit lipophilen Substanzen (Phospholipiden) gearbeitet wurde. Die Charakterisierung der hergestellten Verbindungen erfolgt mittels zweidimensionaler hochaufgelöster NMR-Verfahren und der Massenspektrometrie. Außerdem werden die MR-Eigenschaften mittels Spin-Echo- und Inversion Recovery Sequenzen in ausgewählten Fällen bestimmt. Die kinetische Stabilität bei einigen synthetisierten Verbindungen soll in NMR-Langzeitmessungen durchgeführt werden. Die Affinität dieser Verbindungen zu den Zielrezeptoren wird in Zellexperimenten an PC12-(Pheochromocytoma)-Zellen und C6-(Glioma)-Zellen durchgeführt. Material und Methoden 19 3.0 Material und Methoden 3.1 PC12 adrenale Pheochromocytoma Zellen aus der Ratte PC12-Zellen wurden freundlicherweise von Frau Prof. Richter Landsberg (Universität Oldenburg) zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden in RMPI 1640 Medium mit 10% Pferdeserum und 5% Kälberserum sowie 100 Einheiten Penicillin/Streptomycin und 2mmol/l Glutamin auf Sarstedt Cell+ ® für leicht adhärente Zellen kultiviert. Passagiert wurden die Zellen nach dem Absaugen durch Spülen mit frischem Medium mit anschließender Zentrifugation bei 1200U/min. Dabei erwies sich die Kultur der PC12- Zellen als schwierig, da die Zellen nur ein bis zwei Passagen auf diesen Schalen wuchsen. Die Kulturschalen wurden aus diesem Grund mit Rattenschwanzkollagen (30μg/cm2 ) beschichtet, was aber nicht zur verbesserten Kultur dieser Zelllinie führte. In flüssigem Stickstoff wurden die Zellen in 70% Medium, 20% FCS, 10% DMSO eingefroren und gelagert. 3.2 C6-Glioma Zellen aus der Ratte Die eingefrorenen Zellen der 6. Passage wurden nach dem Auftauen schnellstmöglich in DMEM (Dulbeco´s modified Eagle Medium) mit 5% FCS (Fötales Kälberserum), 2mmol/l Glutamin und 100 Einheiten Penicillin/Streptomycin überführt. Nach der Zentrifugation der Zellsuspension bei 1200U/min für 4 Minuten, wurde das überstehende Medium vorsichtig abgesaugt. Die Zellen wurden in 10ml frischem Medium resuspendiert. Im Anschluß wurden die Zellen in mit 6ml Medium befüllte 10cm Nunc Surface® Kulturschalen ausgesät. Die Kultur der Zellen erfolgte im Brutschrank bei 37°C und 10%CO2. Nach 3-4 Tagen waren die Schalen konfluent bewachsen und wurden passagiert. Das Medium wurde abgesaugt und die Schalen mit 2ml einer Trypsin/EDTA Lösung für 5-10 Minuten bei 37°C / 10%CO2 inkubiert und im Anschluss durch mehrfaches Spülen von der Oberfläche gelöst. Die erhaltene Zellsuspension wurde in ein 50ml Zentrifugenröhrchen mit 20ml frischem Kulturmedium gegeben. Nach Zentrifugation bei 1200U/min für vier Minuten wurde der Überstand abgesaugt und das Zellpellet in Zellkulturmedium resuspendiert und anschließend erneut ausgesät. Die überschüssigen Zellen wurden in einer Lösung bestehend aus 70% DMEM-Medium, 20% Fötales Kälberserum, 10% DMSO bei - 86°C für 12 Stunden eingefroren und anschließend in einem Zelltank bei -196°C in flüssigem Stickstoff gelagert. Material und Methoden 20 3.3 Zellexperimente und Zellaufarbeitung: Die Inkubation der C6-Glioma-Zellen wurde in DMEM-Kulturnedium und 5% FCS sowie 100 Einheiten Penicillin/Streptomycin und Glutamin auf Nunc-Surface® Schalen durchgeführt. Die Zellen wurden von 12-24h inkubiert, wobei das Medium verschiedene Endkonzentrationen des Gd-Komplexes enthielt. Folgende Rechnung ist dabei sehr wichtig: Auf einer konfluenten Schale befinden sich im Schnitt ca. 107 Zellen, die mit einem Volumen von 7ml Medium überschichtet sind. Wie ist also der Konzentrationsbereich für die Inkubation des Kontrastmittels zu wählen? Diese Frage lässt sich beantworten, wenn die Teilchenzahl/Zelle errechnet wird. Bei Endkonzentrationen zwischen 5-50μmol/l sind somit theoretisch 3,011×1012-3,011×1013 Teilchen pro Zelle vorhanden. Aber nicht jedes dieser Teilchen wird an der Zelle binden, da nur eine begrenzte Anzahl an Bindungsstellen vorhanden ist und sich ein Großteil des Kontrastmittels im Medium befindet. Weiterhin kann das Kontrastmittel unspezifisch an der Zelle binden, was durch intensive Waschschritte der Zellen wieder rückgängig gemacht werden soll. Die Inkubationszeit als auch die Konzentration ist so zu wählen, dass keine toxischen Effekte zu erwarten sind. Die Zeitdauer wurde somit für alle Inkubationen auf 12 Stunden bei 10% CO2/37°C begrenzt. Häufig wurde als lösende Komponente Dimethylsulfoxid zugesetzt, wobei darauf geachtet wurde, dass 0,1-Vol-% nicht überschritten wurden, da DMSO das Aufnahmeverhalten von Zellen sehr stark verändert [31]. 3.4 Agarosegelphantom In einer Kulturschale (Ø=5cm) wurden 3ml einer heißen wässrigen Lösung bestehend aus 1,6% Agarose und 0,9% NaCl gefüllt. Nach Abkühlen und Aushärten des Gels wurden mit einer Standbohrmaschine vier 5mm tiefe Löcher in das Agarosegel gebohrt. Die inkubierten Zellen wurden nach dem Waschen mit Medium und PBS-Puffer mit 100μl Medium überschichtet und blasenfrei mittels einer Mikroliterpipette in die Bohrungen pipettiert und mit Medium aufgefüllt. Das Phantom wurde anschließend mit heißer Agar-Lösung überschichtet. Das Medium der überschichteten Zellen verfärbte sich innerhalb von 30Minuten gelb. Da diese Phantomart trotz des Verschließens mit Parafilm sehr schnell austrocknete, beziehungsweise das Medium in das Agarosegel diffundierte Material und Methoden 21 und die Zellen innerhalb einer Stunde trocken lagen, wurde das folgende abgewandelte Agarose-Gel-Phantom entwickelt: 3.5 Eppendorff-Cup-Agarose-Gel-Phantom Die zentrifugierten gewaschenen Zellen wurden nach dem Absaugen des Überstandes mit 1ml Medium überschichtet und anschließend resuspendiert. Die erhaltene Zellsuspensionslösung wurde in ein 1ml Eppendorff Cup´s überführt und in einer Epperdorff-Cup-Zentrifuge 5 Minuten bei 1200U/min zentrifugiert. Die zentrifugierten mit Zellen befüllten Eppendorff Gefäße wurden mittels Haushaltskleber, vorsichtig ohne die Zellpellets aufzuwirbeln auf einen PVCKunststoffträger um das Agarfüllloch herum befestigt. Der Träger wurde in ein auf 5cm gekürztes 100ml Becherglas gestellt. Nun wurde eine 60°C warme frisch bereitete 1,6% Agar-Lösung in 0,9% NaCl-Lösung durch das Befüllloch luftblasenfrei mittels einer Messpipette vollständig eingefüllt. Abb.10: Schematischer Aufbau eines Eppendorff-Cup-Agarose-Gel-Phantom 3.6 MR-Messungen am 4,7T Bruker Biospec Tier-Scanner Das Phantom wurde auf einem Träger befestigt und im Resonator (Sende und Empfangsspule) ausgerichtet. Nach Feineinstellung des Resonators in Bezug zum Phantom („Shimmen“, „Matching“ und „Tuning“) wurde der 90°- und 180°-Pulswinkel bestimmt und die Empfängerverstärkung („Receiver Gain“) eingestellt. Es wurde ein Testbild erstellt (Localizer), anhand dessen der Messbereich (Field of View FOV) möglichst exakt eingestellt wurde. Jetzt wurden Messungen mit verschieden Pulssequenzen, unterschiedlichen Auflösungen und Schichtdicken durchgeführt. 3.7 EPR-(electron paragnetic resonance) Messungen Die X-band EPR Spektren vom Bis-(phenylhyrazido)-DTPA-Gd- und Bis-(2,4- Dinitrophenylhydrazido)-DTPA-Gd-Komplex wurden an einem Bruker EMX Spektrometer aufgenommen, das mit einer Temperiereinheit ausgestattet ist. Material und Methoden 22 Die Signalpositionen wurden unter Verwendung von internen Magnetfeld-Markern gemessen, die von einem NMR-Gaussmeter erzeugt wurden. Die magnetische Feldmodulation betrug dabei 100 kHz (peak-to-peak Amplitude 3G). Die EPRSpektren wurden an einem IBM® Computer unter Verwendung eines Programms, welches am STUBA entwickelt worden ist, zusätzlich simuliert. 3.8 T1-Zeitbestimmungen Die Bestimmung der T1-Zeiten wurden mit der Inversion-Recovery-Pulssequenz durchgeführt: Abb.11: Verwendete Pulsequenz für Inversion Recovery Messungen Es wurden 1mmol konzentrierte Lösungen in bidest. Wasser mittels der InversionRecovery-Sequenz (Abb. 11) ohne Deuteriumlock bei 4,7T (200MHz), 8,46T (360MHz) und 14,1T (600MHz) an einem CH-Dual-Kopf bzw. TXI-Probenkopf gemessen. Es wurde zunächst auf den FID (Freien Induktionsabfall) bzw. auf das Integral des Wassersignals geshimmt. Anhand der Pulssequenz in Abb. 11 ist zu erkennen, dass nach dem 180°X-Puls ein Gradient g0 (t=1ms) geschaltet ist, welcher restliche transversale Magnetisierung dephasiert. Diese modifizierte Puls-Sequenz führte zu einer verbesserten Phase des Wassersignals auch bei kurzen Inversionszeiten. Nach jeder Messung wurde eine Wartezeit d1=12s (entspricht für reines Wasser (bei 8,4T) ca. vier T1-Zeiten) eingehalten. Die Auswertung der Messung erfolgte mittels Integration der gemessen Wassersignale zur jeweiligen Inversionszeit . Das Integral des ersten Messwertes bei =10s wurde auf -1000 Flächeneinheiten normiert und in Bezug zu den Integralen der Messungen bei größeren Inversionszeiten gesetzt. Die 19F-Inversion-Recovery-Messungen wurden ohne Lock mit einem QNP-Probenkopf bei 8,46T an einer 1mmol/l konzentrierten Lösung von Kontrastmittel in Wasser ohne Schaltung des Gradienten durchgeführt. Die Bestimmung der T1-Zeiten erfolgte mittels halblogarithmischer Auftragung (Matlab 6.0.5). gº 180°x 90°x d1 Material und Methoden 23 3.9 T2-Zeitbestimmungen Im Falle des Bis-Normorphin-DTPA-Gd(III)-bisamid-Komplexes wurde die T2-Zeit des Wassersignals einer 1mmol/l Lösung 4,7T (200MHz) mit einem HC-Dual-Probenkopf mit dem Hahnschen-Spin-Echo-Experiments bestimmt. Zwischen den Einzelmessungen wurde ebenfalls 4T1–Zeiten abgewartet, um Verfälschungen der T2-Zeiten durch Restmagnetisierung aus vorangegangenen Scans zu vermeiden. Die Bestimmung der T2-Zeit erfolgte mittels halblogarithmischer Auftragung (Matlab 6.0.5). 3.10 NMR-Kinetik von Bishydrazid-DTPA-Gd-Komplexen Die Stabilität der erhaltenen Hydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexe wurde unter Anwendung eines von Laurent et al. [51] entwickelten Verfahrens untersucht. Die in dieser Arbeit beschriebenen kinetischen Experimente wurden in ihrer Durchführung dahingehend geändert, dass das Reaktionsgemisch im Spektrometer bei 37°C ständig verblieb. Eine 2,5mmol/l Gd(III)-Komplex Lösung wurde in Phosphatpuffer (pH=7) gelöst und bei T=37°C gemessen. Nach Bestimmung des exakten 180°-Pulses wurde mittels Inversion Recovery die T1-Zeit des Wassers bestimmt. Dieser Wert diente als Startwert der Gesamtmessung. Anschließend wurde 1μl einer 250mmol/l-ZnCl2- Lösung zu den bereits im NMR-Röhrchen vorliegenden 999μl Kontrastmittellösung in Phosphatpuffer zugegeben. Daraus ergibt sich eine Endkonzentration von 2,5mmol/l an Zink2+-Ionen. Die Lösung wurde gut durchmischt und die Zeitmessung augenblicklich danach gestartet. Alle zwei Stunden wurde der Pulswinkel des 180°XPulses aufgrund des während der Transmetallierungsreaktion ausgefallenen GdPO4 überprüft bzw. korrigiert. Die zunehmende Signalbreite des Wassersignals ist auf das ausgefallene GdPO4 zurückzuführen. Da das Löslichkeitsprodukt des gebildeten GdPO4 sehr klein ist, ist eine Beeinflussung der T1-Zeit durch in Lösung befindliches Gadolinium kaum gegeben, jedoch ist ein systematischer Fehler zu berücksichtigen, da der Einfluss des paramagnetischen GdPO4 auf die T1-Zeit des Wassers nicht Null ist. Bei den von Laurent et al. [51] durchgeführten kinetischen Messungen wurde vom auftretenden Gd-(III)-PO4-Niederschlag abgetrennt. Ergebnisse und Diskussion 24 4.0 Ergebnisse und Diskussion 4.1 Bishydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexe Die Herstellung von Bis-hydrazid DTPA-Ligandensystemen ist aufgrund der Bifunktionalität der Hydrazine sinnvoll. Eine sterisch nicht zu anspruchsvolle Funktionalisierung am -Stickstoff besitzt einen geringen Einfluss auf die Nukleophilie, weshalb am -Stickstoff trotz Funktionalisierung am -Stickstoff Alkylierungen vorgenommen werden können. Zunehmende sterische Hinderung der Substituenten am Beispiel von DTPA-BisamidGd(III)-Komplexen führt zu labileren Komplexen im Vergleich zum Gd-DTPA [51]. Dies liegt am höheren Substitutionsgrad der Bisamid-Komplexe und der damit labileren Koordination der Amid-Bindungen im Vergleich zur Carboxylat-Gruppe. Die eingeführte Hydrazid-Gruppe enthält trotz Abschwächung der koordinativen Wechselwirkung zum Zentralion eine zusätzliche Koordinationsstelle (-Stickstoff). Diese zusätzliche Koordinationsstelle kann zu einer Stabilitätserhöhung führen. Die Darstellung von Bis-Hydrazid-Ligandensystemen aus DTPA-Bisanhydrid verlief aufgrund der größeren Nukleophilie der Hydrazine im Vergleich zu den Aminen äußerst effektiv, was sich in den verkürzten Reaktionszeiten, sowie in der niedrigeren Reaktionstemperatur zeigte. Einige Hydrazin-Verbindungen werden oder wurden als Arzneimittel eingesetzt, was potentielle Umsetzungen von Hydrazinen mit DTPABisanhydrid interessant macht. 4.1.1 Bis-Phenylhydrazido-DTPA-Ligand und Gd-(III)-Komplex HN NH2 O N N N O OH O O O O O N N N O OH O O N H N H N N H H O OH O OH N N N O O O O N H N H N N H H O O O O Gd3+ + 2 Die Umsetzung von DTPA-bisanhydrid mit Phenylhydrazin in trockenem Dimethylformamid (DMF) führte zur Zielverbindung bestätigt durch 1 H- und 13C-NMRSpektroskopie. Auch nach mehreren Waschschritten mit Chloroform und Acetonitril war immer noch DMF nachweisbar. Umkristallisationsversuche aus verschiedenen protisch polaren organischen Lösungsmitteln scheiterten. Die Verbindung wurde anschließend mit GdCl3×6H20 komplexiert und der Gadolinium Komplex als feiner weißer Feststoff erhalten. Ergebnisse und Diskussion 25 4.1.2 Bis-2,4-Dinitrophenylhydrazido-DTPA-Ligand und Gd(III)-Komplex HN NH2 NO2 NO2 O N N N O OH O O O O O N N N O OH O O N H N H N N H H O OH O NO OH 2 O2N NO2 NO2 N N N O O O O N H N H N N H H O O NO2 O2N NO2 NO2 O O Gd3+ + 2 357,32 g/mol C14H19N3O8 198,14 g/mol C6H6N4O4 753,60 g/mol C26H31N11O16 907,85 g/mol C26H28GdN11O16 Die Reaktionsführung war bis auf die Reaktionsdauer analog zur Synthese des Bisphenylhydrazido-DTPA-Liganden. Der Grund hierfür ist in dem sterischen und elektronischen Einfluss der Nitrogruppen auf die Nukleophilie des -Stickstoffs zu sehen. Da das 2,4-Dinitrophenylhydrazin ein Molekül Kristallwasser enthält und dieses sehr schwer zu entfernen ist, wurde das im Vergleich zum Produkt stark untergeordnete monosubstituierte Produkt beobachtet. Das Produkt war ein leuchtend gelber amorpher Feststoff mit geringer Löslichkeit in Wasser, was nach entsprechender Charakterisierung eine Komplexierung in einer Ethanol/Wasser Mischung erforderte. Bei der Komplexierung trat eine starke pH-wertabhängige Farbveränderung von gelb (pH-Bereich 1,8-2,5) über hellrot (pH-Bereich 2,5-4) zu dunkel violett (pH-Bereich 4-7) auf. Nach dem Entsalzen mittels Festphasenextraktion (QMA-Patrone Waters) wurde ein gelber Feststoff erhalten, der in ESI-MS-Spektren als Produkt identifiziert wurde. Das Dimere als auch das Radikal wurden nicht im ESI-MS-Spektrum beobachtet. Zur Erklärung der beschriebenen Farbänderung während der Komplexierung kommen folgende Möglichkeiten in Betracht. 1.) N-Pikryl-N´,N´-diphenylhydrazin [46] ist mittels PbO2 Chloroform zum Radikal oxidierbar. Das gebildete Radikal ist als Feststoff über Jahre hinweg stabil. R N O N H H NO2 NO2 R N O N H NO2 NO2 R N O N H C NO2 NO2 R N O N H C NO2 NO2 [Ox] 2.) Am -Stickstoff ist ein Proton gebunden, welches durch den Einfluss der beiden Nitrogruppen acide ist und deprotoniert werden kann. Das gebildete Anion ist resonanzstabilisiert, wobei die Nitrogruppen an der Delokalisation der negativen Ladung beteiligt sind. Ein Push-Pull-Effekt führt zu einer starken Farbveränderung die pH-Wert abhängig ist. R N O N H H NO2 NO2 R N O N H NO2 NO2 R N O N H NO2 NO2 - +B - - -HB Ergebnisse und Diskussion 26 N-Oxid-DTPA-Gd-Radikalkomplexe sind in der Literatur beschrieben und deren paramagnetische Eigenschaften charaterisiert [45]. Um eine genauere Aussage zwecks Klärung der Farbveränderung während der Komplexierung treffen zu können, wurden zwei Hydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexe am STUBA (Slovenská technická univerzita v Bratislave) freundlicherweise von Herrn Dr. Marian Valko mittels Elektronenspin Resonanz Spektroskopie (EPR) untersucht. 4.1.3 Diskussion der EPR-Spektren Das Gd3+-Ion hat eine 4f7 Elektronenkonfiguration (S7/2). Die gemessenen und simulierten EPR-Spektren sind in Abb.12 dargestellt. Der Spin-Hamilton-Operator des Gd3+-Ions lautet:       ( 1)  (  ) 3 2 1 2 2 H BgS D Sz S S E Sx S y [52] g ist der g-Tensor, D und E sind die zero-field splitting (ZFS) Parameter. Oben genannte Gleichung kann unter Berücksichtigung der Störungstheorie entsprechend der zwei Bedingungen angewendet werden: 1) Eine starke Zeeman-Wechselwirkung (Erster Teil in obiger Gleichung) und ein schwaches Kristallfeld des Gadolinium-Ions führt zu BgS >> D, E, woraus ein breites Signal um g = 2 im EPR-Spektrum resultiert [53]. 2) Im Falle eines starken Kristallfeldes des Gadolinium-Ions gilt; D, E >> BgS [54]. Das freie Gd3+-Ion besitzt die achtfache Spin-Entartung (S = 7/2). Das starke Kristallfeld spaltet diese Energieniveaus in vier zweifach entartete Energieniveaus auf. Das Zeeman-Feld beseitigt diese Entartungen. Eine Konsequenz ist die Möglichkeit des Elektronenübergangs der ungepaarten Elektronen zwischen diesen Energieniveaus, welches zu zusätzlichen Signalen bei g >> 2.00 und g < 2.00 führt. Signale bei niedrigem Feld befinden sich bei g = 3,44 und werden in den EPRSpektren beider Verbindungen beobachtet. Die Spektren wurden unter Anwendung des zero-field splitting Parameters D simuliert. Ergebnisse und Diskussion 27 0 2000 4000 6000 8000 simulation experiment Magnetic Field (Gauss) Abb. 12: Das EPR-Spektrum vom Bis-(2,4-Dinitrophenylhydrazido)-DTPA-GdKomplex zusammen mit der computergestützten dform-Simulation. Mit den EPR-Parametern g(eff) = 2.001, D = 370 Gauss, Lorentz/Gauss = 1, spektralen Bandbreite von: Bx = 900 Gauss, By = 850 Gauss, Bz = 570 Gauss. Als Ergebnis bleibt festzuhalten, dass die EPR-Messung dieser beiden GadoliniumDTPA-Hydrazid-Komplexe im Festkörper (Abb. 12) sehr ähnliche, ja fast identische Spektren ergab und keine Radikale beobachtet wurden und dies für eine Deprotonierung am -Stickstoff spricht. Über einen ähnlichen pH-wertabhängigen Farbeffekt wird ebenfalls in der Arbeit von Woods et al. berichtet, in der ein pNitrophenol-DO3A-Gd(III)-Komplex vorgestellt wird [16] Die Lösung des ebenfalls beschriebenen Ytterbium-(III)-Komplexes zeigte eine starke Farbänderung, die zudem mit einer Änderung der Relaxivität des Wassersignals bei pH-Wertänderung im MR-Experiment einhergeht. Dieser Effekt ermöglicht eine pH-Wertmessung durch MR-Bildgebung anhand des beobachteten T1-Kontrastes. 4.1.4 Bis-(tertbutyl-carbamoylhydrazido)-DTPA-Ligand und Gd(III)-Komplex HN NH2 O O O N N N O OH O O O O O N N N O OH O O N H N H N N H H O OH O OH O O O O N N N O O N H N H N N H H O O O O O O O O O O Gd3+ + 2 357,32 g/mol C14H19N3O8 132,16 g/mol C5H12N2O2 621,65 g/mol C24H43N7O12 775,90 g/mol C24H40GdN7O12 DMF/60°C/2h/N2 GdCl3/NaOH/H2O Die Zielverbindung wurde analog zur Synthese des Bis-(Phenylhydrazido)-DTPALiganden dargestellt. Mehrmals durchgeführte intensive Waschschritte des Ergebnisse und Diskussion 28 Produktes mit Chloroform, Acetonitril und Ether führten nicht zur Abtrennung des Lösungsmittels DMF, was als Verunreinigung in den 1 H- und 13C-NMR-Spektren zu beobachten war. Umkristallisationsversuche blieben erfolglos, aufgrund der unzureichenden Löslichkeit des Liganden in organischen Lösungsmitteln. Der Ligand ist in bipolaren Lösungsmitteln bzw. protisch polaren Lösungsmitteln löslich. Die folgende Komplexierung ergab das Produkt als weißen Feststoff in guter Ausbeute. 4.1.5 Bis-(Hydrazido)-DTPA-Gd(III)-Komplex N N N O O N H N H N N H H O O O O O O O O O O Gd3+ N N N O O N H N H NH2 H2N O O O O O O Gd3+ TFA /H2O/i-Pr3SiH/ 0°C/ 30min -2 -2 CO2 775,90 C24H43GdN7O12 573,66 C14H24GdN7O8 Diese Zielverbindung ist als Bishydrazid bifunktionell und als Synthesebaustein für das „pre-Loading“-Konzept von Interesse. Da dieser Komplex nukleophil ist, sollte er beispielsweise mit Ketonen, Carbonsäuren, Aldehyden, Phosphorhalogeniden zu oligomeren Gadoliniumkomplexen reagieren. Der Syntheseweg über ein geschütztes monofunktionelles Hydrazid ist nötig, da bei der Reaktion des DTPA-Bisanhydrids mit wasserfreiem Hydrazin eine Polymerisation einsetzt. Die Darstellung dieser Koordinationsverbindung erwies sich als sehr schwierig und wurde unter variierenden Bedingungen (Temperatur, Mischungsverhältnis der Lösung bestehend aus Trifluoressigsäure/Triisopropylsilan/Wasser, Reaktionszeit) mehrmals durchgeführt. Nach Aufarbeitung wurde ein farbloses Öl beobachtet, dass sich nicht zur Kristallisation bringen ließ. ESI-Massenspektren zeigten die partielle Abspaltung der BOC-Schutzgruppen, als auch die Bildung der vollentschützten Zielverbindung. Eine weitergehende Untersuchung dieses Komplexes wurde nicht vorgenommen. 4.1.6 T1-Relaxationszeiten von Bis-Hydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexen Die Bestimmung der T1-Zeiten wurde durch halblogarithmische Auftragung von ln((I0- I)/ I0) zur Inversionszeit  durchgeführt. Die Steigung der erhaltenen Geraden entspricht der negativen Relaxivität –R1. Mit MatLab 6.0.5 wurden Linearfits durchgeführt und die Fehler berechnet. Ergebnisse und Diskussion 29 T1 (4,7T)[ms] T1 (8,5T)[ms] T1 (14,1T)[ms] Bis-(phenylhydrazido)-DTPA-Gd 188,0±14 Bis-(phenylhydrazido)-DTPA-Gd 284,2±1,9 Bis-(phenylhydrazido)-DTPA-Gd 313,5±1,5 Bis-(tert-butylcarbamoyl-hydrazido)-DTPAGd 309,7±4,1 Bis-(tert-butylcarbamoyl-hydrazido)-DTPAGd 335,9±3,4 Bis-(tert-butylcarbamoyl-hydrazido)-DTPAGd 346,8±2,0 Bis-(2,4-dinitrophenylhydrazido)-DTPA-Gd 66,4±1,3 Bis-(2,4-dinitrophenylhydrazido)-DTPA-Gd 70,0±1 Bis-(2,4-dinitrophenylhydrazido)-DTPA-Gd 71,1±0,7 Tab.3 T1-Zeiten der dargestellten Bis-Hydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexe in H2O bei verschieden Feldstärken N N N O O O O N H N H N N H H O O O O Gd3+ O O O O N N N O O O O N H N H N N H H O O O O Gd3+ O O O O N N N O O O O N H N H N N H H O O O O Gd3+ O O O O N N N O O O O N H N H N N H H O O O O Gd O2 N 3+ O2 N NO2 NO2 N N N O O O O N H N H N N H H O O O O Gd O2 N 3+ O2 N NO2 NO2 N N N O O O O N H N H N N H H O O O O Gd O2 N 3+ O2 N NO2 NO2 N N N O O O O N H N H N N H H O O O O Gd3+ N N N O O O O N H N H N N H H O O O O Gd3+ N N N O O O O N H N H N N H H O O O O Gd3+ Gd Ergebnisse und Diskussion 30 Die gemessenen T1-Zeiten nehmen für die einzelnen Komplexe mit größerer Feldstärke zu. Die bestimmten Werte sind bei gleicher Feldstärke mit denen von bereits in der Literatur beschriebenen DTPA-Bisamid-Gd(III)-Komplexen vergleichbar. Die beiden untersuchten gleichkonzentrierten wässrigen Lösungen des BisPhenylhydrazido-DTPA-Gd(III)- und des Bis-tert-butylcarbamoylhydrazido-DTPAGd(III)-Komplexes besitzen ähnliche Relaxationseigenschaften, was auf ähnliche sterische und elektronische Substituenteneinflüsse schließen lässt. Erkennbar ist, dass das 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Derivat die T1-Zeit des Wassers im Vergleich zu den anderen beiden Hydrazid-DTPA-Gd-Komplexen stark verkürzt. Der Einfluss der Substituenten wird in Transmetallierungskinetiken deutlicher, die die beobachtete starke T1-Zeitverkürzung im Falle des Bis-(2,4-Dinitrophenylhydrazido)- DTPA-Gd(III)-Komplexes erklären werden. (s. 4.1.7) 4.1.7 NMR-Kinetik von Gd(III)-DTPA-Bishydrazid-Komplexen Hydrazine sind bifunktionell, die nach Reaktion mit dem DTPA-Bisanhydrid zum Bishydrazido-DTPA-Liganden zwei zusätzliche Koordinationsstellen an den - Stickstoff-Atomen der Hydrazid-Bindungen enthalten. Die Möglichkeit der Deprotonierung in -Position der Hydrazidbindung sollte zu einer ionischen Wechselwirkung mit dem Gd(III)-Zentralion und somit zu einer vergrößerten Stabilität gegenüber einer Transmetallierungreaktion mit Zinkionen führen. O N N N O O O O N H O N H O O N H N H Gd O 3+ O O O Zn2+ O N N N O O O O N H O N H O O N H N H Zn O 2+ O O O GdPO4 Phosphatpuffer - + Abb. 13 Tranmetallierungsreaktion eines Gd-(III)-DTPA-bishydrazid-Komplexes in Gegenwart von Zink in Phosphatpuffer pH=7 Da sich die Relaxationszeiten nach Reaktionsbeginn sehr schnell ändern, wurde versucht, möglichst viele Datenpunkte nach Reaktionsbeginn zu erhalten. Deshalb wurde die Bestimmung der T1-Zeit zur jeweiligen Reaktionszeit anhand des Nulldurchgangs der Inversion Recovery Messung bestimmt, die mit einem großen Ergebnisse und Diskussion 31 Fehler behaftet ist. Im Gesamtverlauf der Messung wurden die Parameter (Pulswinkel, Shim) mehrmals überprüft und zum Ende der Messung leicht korrigiert. Die Reaktionszeit wurde bei Darstellung des Nulldurchgangs auf dem Bildschirm abgelesen. Die graphische Auftragung der normierten Relaxivität (Relaxivität zur Zeit t dividiert Relaxivität zur Zeit t=0) zur Reaktionszeit t zeigt Abb. 14. [51] Abb.14 Links: Zerfallskurve der beiden Bishydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexe (Bis-(phenylhydrazido)-DTPA-Gd, Bis-(tert-butylcarbamoylhydrazido)- DTPA-Gd) Rechts: Zerfallskurven von DTPA-bisamid-Gd(III)-Komplexen bestimmt von Laurent et al. [51] Kontrastmittel-Gd(III)-Komplex R1(t=4320min)/ R1(t=0) Gd-DOTA[51] 0,99 Gd-DTPA[51] 0,49 MS-325[51] 0,75 Bis-Phenylhydrazido-DTPA-Gd(III) (t=773min) 0,10 Bis-(tert-Butylcarbamoylhydrazido)-DTPA-Gd(III) (t=694min) 0,10 Tab.4 Normierte Relaxivitäten von verschiedenen Gd(III)-Komplexen nach angegebener Reaktionszeit der Transmetallierungsreaktion mit Zn2+-Ionen Die longitudinale Relaxationszeit des Wassers vergrößert sich im Reaktionsverlauf, was durch eine Abnahme der Gd(III)-Komplexkonzentration bzw. der Zunahme der Ergebnisse und Diskussion 32 Zink-Komplexkonzentration zu verstehen ist. Die bei der Transmetallierungsreaktion freiwerdenden Gadoliniumionen, werden durch den großen Phosphat-Überschuss gefällt und haben somit auf das Relaxationsverhalten des Wassers einen vernachlässigbaren Einfluss. (KL(GdPO4) =10-22,26mol2 /l2 ) [55] Die Messung der Transmetallierungsreaktion des Bis-(2,4-Dinitrophenylhydrazido)- DTPA-Gd-Komplexes verlief nach Zinkzugabe sehr schnell, sodass bereits nach 45 Minuten die T1-Relaxationszeit des Wassersignals über 2 Sekunden betrug. Dieser Wert blieb über Stunden hinweg konstant. Außerdem trat beim Lösen des Bis-(2,4- Dinitrophenylhydrazido)-DTPA-Gd(III)-Komplexes in Phosphat-Puffer pH=6,8 ein weißer Niederschlag (GdPO4 bzw. Zn3(PO4)2) auf. Aus den vorhandenen Daten wurde versucht die Geschwindigkeitskonstante k für diese beiden Transmetallierungsreaktionen anhand der Gleichung von Laurent et al. [51] zu ermitteln. kt LigGd LigGd LigGd LigGd t              [ ] [ ] [ ] [ ] ln 0 LigGd t [ ] Konzentration des Gadoliniumkomplexes zur Zeit t [LigGd] Konzentration bei t= (Letzter Wert der Messung) 0 [LigGd] Anfangskonzentration zur Zeit t=0 Da die Konzentration des Gadoliniumkomplexes jederzeit proportional zur Relaxivität R1 ist, können die gemessen Relaxivitäten zu den gemessen Zeiten eingesetzt werden. Die Auftragung der zeitabhängigen Relaxivitäten nach der Gleichung von Laurent et al. [51] ergab keinen linearen Zusammenhang. Dies ist zum einen durch einen verfrühten Abbruch der Reaktion nach 694min bzw. 773min zu erklären. Des weiteren wurde der nichtlineare Verlauf von Laurent et al. bei der Bestimmung der Geschwindigkeitskonstante in einigen Kontrastmittelzerfallskinetiken beschrieben, wobei diese Transmetallierungsreaktionen nicht mit den Gleichungen einer Kinetik 2. Ordnung beschrieben werden können [56, 57]. Zudem besteht ein Einfluß des gefällten GdPO4 auf das Wasser. Die durchgeführten Experimente zeigen die Instabilität der Bis-Hydrazid-DTPA-Komplexe und erklären die starke T1-Zeitverkürzung des Bis-2,4- Dinitro-phenylhydrazido-DTPA-Gd(III)-Komplexes. Der Verlauf der Zerfallskurven steht in guter Realtion zu den von Laurent et al. bestimmten Zerfallskurven der Bis- Ergebnisse und Diskussion 33 amid-DTPA-Gd(III)-Komplexe und bestätigt die Vermutung, das die BishydrazidDTPA-Gd-(III)-Komplexe instabiler als alle DTPA-Bisamid-Gd(III)-Komplexe sind. 4.2 Polyfluorierte Bis-Benzylamid-DTPA-Gd(III)-Komplexe Folgende Edukte wurden verwendet: 4-Fluorbenzylamin, 3,5-Bistrifluoromethylbenzylamin, 3,5-Bis-trifluormethylbenzylalkohol 4.2.1 Bis-(4-fluorbenzylamido)-DTPA-Gd(III)-Komplex NH2 F O N N N O OH O O O O O N N N O OH O O N H N H O OH O OH F F N N N O O O O N H N H O O O O Gd3+ F F + 2 Die Umsetzung von DTPA-Bisanhydrid mit 4-Fluorbenzylamin in trockenen DMF verlief problemlos zum gewünschten DTPA-bisamid-Liganden. Trotz der intensiven Waschvorgänge konnte das DMF nicht vollständig aus dem Produkt entfernt werden. Die erhaltene Verbindung wurde mittels hochaufgelöster 1 H-, 13C- und 19F-NMRSpektroskopie sowie mittels ESI-MS charakterisiert. Die anschließende Komplexierung erfolgte in Wasser. Die Verbindung wurde als weißer Feststoff nach dem Entsalzen und Lyophilisieren erhalten, und mittels 19FNMR-Spektroskopie in Wasser untersucht. Das 19F-NMR-Signal war sehr breit und kaum zu detektieren und lag bei der entsprechenden chemischen Verschiebung des Liganden. Dieser Effekt ist auf die paramagnetischen Eigenschaften des Gadolinium(III)-Zentralions, sowie die hohe Anzahl an heteronuklearen HFKopplungen zurückzuführen. 4.2.2 Bis-(3,5-trifluormethylbenzylamido)-DTPA-Gd(III)-Komplex NH2 CF3 F3C O N N N O OH O O O O O N N N O OH O O N H N H O OH O OH CF3 F3C F3C CF3 N N N O O O O N H N H O O CF3 F3C F3C CF3 O O Gd3+ + 2 Die Darstellung und Aufreinigung dieser Verbindung erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie die Darstellung des Bis-(4-Fluorbenzylamido)-DTPA-Liganden. Die Komplexierung wurde in einer Wasser/Ethanol-Mischung 4:1 durchgeführt, da der Ligand in Wasser schlecht löslich ist. Ligand und Komplex wurden erhalten und mittels 1 H-, 13C- und 19F- bzw. im Falle des Komplexes mittels 19F-Kernresonanz Ergebnisse und Diskussion 34 Spektroskopie, sowie über ESI (Elektrospray Ionisation)-Massenspektrometrie charakterisiert. Es handelt sich, wie an der Struktur zu erkennen ist, um eine symmetrische Verbindung. Die vier im Molekül enthaltenen Trifluormethyl-Gruppen sind chemisch und magnetisch äquivalent. Im 19F-NMR-Spektrum des Gadolinium-Komplexes und des Liganden wurden zwei sehr dicht beieinander liegende Singuletts bei = -62ppm im Integralverhältnis 2:1 beobachtet. ESI-MS-Spektren zeigten lediglich das Produkt an. Beide 19F-NMR-Signale liegen im typischen aromatischen CF3-Verschiebungsbereich und weisen für den polytrifluormethylierten DTPA-Gd(III)-Komplex aufgrund des Paramagnetismus des Gadolinium-Zentralions eine starke Linienverbreiterung auf. Die Aufnahme von temperaturabhängigen 19F-NMR-Spektren bei 308K, 303K, 298K, 293K zeigten eine temperaturabhängige chemische Verschiebung der aromatischen CF3-Signals des Komplexes im 19F-NMR-Spektrum. 4.2.3 Bis-(3,5-trifluormethylbenzyl)-DTPA-diester Gd-Komplexes OH CF3 F3C O N N N O OH O O O O O N N N O OH O O O O O OH CF3 F3C F3C CF3 HO O N N N O O O O O O O O CF3 F3C F3C CF3 O O Gd3+ + 2 Diese Reaktion wurde unter analogen Bedingungen wie bei der Darstellung des Bis- (3,5-Trifluormethylbenzylamido)-DTPA durchgeführt. Im ESI-MS-Spektrum war wenig Produktsignal zu beobachteten, was auf eine partielle Hydrolyse des DTPABisanhydrid hinweist. Durch den starken induktiv ziehenden Effekt der CF3-Gruppen in meta-Position kommt es zu einer Aktivierung der Benzylposition und damit auch der Ester-Gruppe, die die Labilität der Esterbindung gegenüber Nukleophilen erklärt. Eine Komplexierung in Wasser/Ethanol-Mischungen mit einem Ethanolanteil von bis zu 50% blieb erfolglos. Die gebildeten Produkte waren laut ESI-MS-Spektren das [Gd(III)-DTPA]2- und der 3,5-Bis-trifluormethylbenzyl-DTPA-Gd(III)-monoester Komplex. Um die koordinative Titelverbindung zu erhalten wurde auf eine Komplexierung in protisch polaren Lösungsmitteln verzichtet und die Komplexierung in trockenem DMF unter Zugabe von drei Äq. Triethylamin durchgeführt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels und sorgfältigen Waschen des Rückstandes mit Ether, Chloroform zeigten ESI-MS-Spektren den bisfunktionalisierten DTPA-Gd(III)-diesterKomplex. Ergebnisse und Diskussion 35 4.2.4 1 H- und 19F-T1-Zeit-Messungen der polyfluorierten Gd-Komplexe Die Bestimmung der 1 H- und 19F-T1-Zeiten des Komplexes wurde an 1mmol/lkonzentrierten wässrigen Lösung durchgeführt. Aufgrund der schlechten Qualität der 19F-NMR-Spektren des Bis-(3,5-Bis-Trifluormethylbenzyl)-DTPA-Gd-diesterKomplexes bzw. des Liganden, wurden nur unzureichende 19F-Inversion Recovery Graphen erhalten. Die 1 H-T1-Messungen zeigen den verkürzenden Effekt der T1-Zeit des Wassers. Die Relaxivitäten liegen im vergleichbaren Relaxivitätsbereich von anderen DTPA-bisamid-Gd(III)-Komplexen und DTPA-Gd-diester Komplexen. Die starke Linienverbreiterung und das schlechte Signal zu Rausch Verhältnis der Signale ist auf einen starken T2-Effekt zurückzuführen. Die Linienhalbwertsbreite beträgt im Gd(III)-Komplex 1/2=14,76Hz. Dabei ist in beiden Fällen T1 mittels der halblogarithmischen Auftragung von ((I0-I)/I0) zu  (Tab. 5) bestimmt worden. Der Vergleich der beiden T1-Zeiten (Tab. 5) des fluorierten DTPA-bisamid-Liganden und des korrespondierenden DTPA-bisamid-Gd(III)-Komplex zeigt verkürzte T1-Zeit um Faktor 7. Eine mögliche Erklärung ist eine Wechselwirkung der im Vergleich zum umgebenden Wasser schneller relaxierenden Solvathülle (outer sphere) des GdKomplexes, die durch Austausch von schnell relaxierendem Wasser aus der direkten Koordinationssphere (inner sphere) mit dem Wasser der Solvathülle (outer sphere) des Gd(III)-Komplexes resultiert [2]. Die Solvathülle des Komplexes kann das T1- Relaxationsverhalten der CF3-Gruppen beeinflussen. Als Ergebnis bleibt fest zu halten, dass die longitudinalen Relaxationszeiten von Heteroatom-funktionalisierten Gd-Komplexen im Vergleich zu den nicht komplexierten Liganden verkürzt sind. Fluor besitzt einen Kernspin von I=½ und eine natürliche Häufigkeit von 100% und 88% der Protonenempfindlichkeit und ist deshalb besonders für bildgebende Verfahren interessant. Ergebnisse und Diskussion 36 19F T1 (8,5T)[ms] (c=1mmol/l) in Wasser1 bzw. H2O/DMSO(4:1)2 1 H T1 (8,5T)[ms] (c=1mmol/l) in Wasser1 bzw. H2O/DMSO(4:1)2 Bis-(3,5-Trifluormethylbenzyl)-DTPA-Gd(III)- diester2 Bis-(3,5-Trifluormethylbenzyl)-DTPA-Gd(III)- diester2 95±6 Bis-(3,5-Trifluormethylbenzylamido)-DTPALigand1 1481±38 Bis-(3,5-Trifluormethylbenzylamido)-DTPALigand1 Bis-(3,5-Trifluormethylbenzylamido)-DTPAGd(III)1 206±24 Bis-(3,5-Trifluormethylbenzylamido)-DTPAGd(III)1 149,4±0,8 Tab.5 T1-Zeiten des Wassersignals sowie des 19F-NMR-Signals in Wasser bzw. H2O/DMSO(4:1) N N N O O O O N H N H O O CF3 F3 C F3C CF3 O O Gd3+ N N N O O O O N H N H O O CF3 F3 C F 3 C CF3 O O Gd N 3+ N N O O O O N H N H O O CF3 F3 C F3 C CF3 O O Gd3+ N N N O OH O O N H N H O OH O OH CF3 F3 C F3 C CF3 Ergebnisse und Diskussion 37 Das Element Fluor ist im lebenden Organismus gering konzentriert, wodurch eine gute Detektierbarkeit, ohne Störung durch andere fluorierte Substanzen, möglich ist. Das Einbringen von 19F-Atomen in einen Gadolinium-Komplex führt zudem zu einer erheblichen Lipophilie-Erhöhung, die an der schlechten Löslichkeit der Gd-Komplexe in Wasser zu erkennen ist. Eine beschleunigte Relaxation der 19F-Atome macht eine schnellere Akquisition von Einzelmessungen möglich. 4.2.5 Temperatureffekte des 19F-NMR-Signals von fluorierten DTPAKomplexen In dem Patent von Platzek et al. [48] wird auf die temparaturabhängige Verschiebung des 19F-NMR-Signals von fluorierten Lanthanoid-DOTA-Komplexen eingegangen. Für den fluorierten Praseodym(III)-Komplex ist die größte temperaturabhängige Verschiebung des 19F-NMR-Signals des Komplexes (0,49ppm/K) beobachtet worden. Die Größe der Temperaturverschiebung des 19F-NMR-Signals des fluorierten DOTA-Dy(III)-Komplexes (0,016ppm/K) steht in guter Relation mit dem 19F-CF3-NMR-Signal des Bis-(3,5-bistrifluoromethylbenzylamido)-DTPA-Gd(III)- Komplexes. Das zweite 19F-CF3-NMR-Sigulett bei  = -61,7 ppm konnte nicht zugeordnet werden. - 61. 6 - 62. 0 - 62. 4 - 62. 8 - 63. 2 - 61. 6 - 62. 0 - 62. 4 - 62. 8 - 63. 2 - 61. 6 - 62. 0 - 62. 4 - 62. 8 - 63. 2 - 61. 6 - 62. 0 - 62. 4 - 62. 8 - 63. 2 - 61. 6 - 62. 0 - 62. 4 - 62. 8 - 63. 2 - 61. 6 - 62. 0 - 62. 4 - 62. 8 - 63. 2 - 61. 6 - 62. 0 - 62. 4 - 62. 8 - 63. 2 - 61. 6 - 62. 0 - 62. 4 - 62. 8 - 63. 2 ( p p m) S e p ar a t e Pl o t 276K 286K 291K 294K 297K 300K 303K 306K Abb. 15 19F-NMR-Spektren des Bis-(3,5-bistrifluoromethylbenzylamido)-DTPAGd(III)-Komplexes in H20 bei verschiedenen Temperaturen(276K-306K) [c=1mmol/l] Ergebnisse und Diskussion 38 In Abb. 15 sind 19F-NMR-Spektren vom Bis-(3,5-bistrifluormethylbenzylamido-Gd(III)- Komplex (1mmol/l in H2O) bei verschiedenen Temperaturen ohne Deuterium Lock aufgenommen. Die Auftragung der chemischen Verschiebung des 19F-Signals zur Temperatur [K] (Abb.16) gibt diesen Effekt wieder und ermöglicht die Bestimmung der Änderung der chemischen Verschiebung pro Temperatureinheit [K]. Die Steigung der erhaltenen Geraden, beträgt beim trifluormethylierten DTPA-bisamid-Gd(III)- Komplex   1 0,0099     ppm K T  Abb.16 Chemische Verschiebung [ppm] des intensivsten CF3- 19F-NMR-Signal aufgetragen gegen die Temperatur Die chemische Verschiebung der 19F-NMR-Signale der von Platzek et al. dargestellten Komplexe ist temperaturabhängig und könnte für Temperaturmessungen (in vivo) eingesetzt werden. Temperaturmessungen sind in vivo auch mit Hilfe eines nichtfluorierten Thulium-DOTMA-Komplexes möglich. [50] Exemplarisch sind in Tab. 6 NMR-Verschiebungsdaten für den Dysprosium- und Praseodym-Komplex des N-(2-hydroxy-2-trifluormethyl-ethyl)-N´,N´´,N´´´- tricarboxymethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecans abgebildet [48]. Metallatom Dysprosium Praseodym Temp. Gradient [ppm/K] 0,016 0,49 Chem. Verschiebung  [ppm] -82,6 -160 Linienhalbwertsbreite 1/2 [Hz] 35 300 Rel. Genauigkeit 0,45*10-3 1,4*10-3 Tab. 6 Änderung der chemischen Verschiebung des 19F-NMR-Signals bei 250MHz zwischen 26-46°C anhand einer 0,01mM-Komplexlösung des N-(2-hydroxy-2-trifluormethyl-ethyl)-N´,N´´,N´´´-tricarboxymethyl- 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-Pr(III)- bzw. Dy-Komplexes bestimmt [48]. Ergebnisse und Diskussion 39 4.3 Allgemeine Synthese von Bis-Steroid DTPA- und TTHA-diester-Gd(III)- Komplexen O N N N O OH O O O O O ROH OR O N HO O N N O HO O O OH RO O O O OH OH H H H O HO O OH OH H H H O HO O OH H H H O HO O OH F H H OH HO H H H HO H H H OH O H HO H H H O GdCl3/NaOH in H 2O/EtOH O N N N O O O O O O O Gd3+ OR RO + 2 DMF/60°C/N2-Atmosphäre Cortison Hydrocortison(Cortisol) Corticosteron Dexamethason Cholesterin Lithocholsäure Androsteron ROH O O O OH OH H H H O O O OH OH H H H O HO O OH OH H H H O HO O OH F H H OH GdCl3/NaOH in H 2O/EtOH N N N O Gd3+ O N O OR O O O O OR O O O O N O O N N N O OH O O O OH O OR O N HO O N N O HO O O OH RO N O OH + 2 DMF/60°C/N2-Atmosphäre Prednison Cortison Hydrocortison(Cortisol) Dexamethason -1 Die Synthese dieser bissteroidalen TTHA- und DTPA-diester-Verbindungen verläuft bis auf die verlängerte Reaktionszeit analog zu den DTPA-bisamid-Synthesen. Die verlängerte Reaktionszeit erklärt sich aus der schlechteren Nukleophilie der Hydroxyl-Gruppe und das größere Molekulargewicht der Steroide. Das oben angegebenene Syntheseschema zeigt, dass sowohl in 3-Position als auch in 19- Position eine Funktionalisierung möglich ist. Die cis-Verknüpfung zwischen Ring A und Ring B in der Lithocholsäure hat keinen Einfluss auf die Bildung des Produkts. Die Bildung des Corticosteron-, Dexamethason- und des Hydrocortisonesters erfolgte regioselektiv in Position 21. Bei der Aufarbeitung wurden alle flüchtigen Bestandteile entfernt. Der erhaltenene weiße Rückstand wurde mit Chloroform, Acetonitril gewaschen. Problematisch war das Entfernen des Dimethylformamids aus dem Rückstand. Umkristallisationsversuche aus Wasser/Ethanol-Mischungen, Butanol, Chloroform, THF brachten keinen Erfolg. Die schlechte Löslichkeit des DTPA- und des TTHA-Bisanhydrids in polaren und apolaren organischen Ergebnisse und Diskussion 40 Lösungsmitteln (Chloroform, Dichlormethan, Diethylether, Tetrahydrofuran, Acetonitril, Pyridin) machten hochsiedende bipolare Lösungsmittel (Dimethylformamid, Tetramethylharnstoff) für diese Reaktion erforderlich. Als Nebenprodukt wurden die monosubstituierten Steroid-Derivate des DTPA- und des TTHA beobachtet, die durch eine partielle Hydrolyse des DTPA-bisanhydrid bzw. des bis-steroidalen-DTPA-diester zu erklären sind. Dieses Ergebnis wird durch die Anwesenheit nicht veresterten Steroids belegt, welches ebenfalls in erheblichen Mengen bis zum Verhältnis Steroid/ MonosteroidDTPA-ester/ Bis-Steroid-DTPA-diester = 1:1:1 auftrat. Bestimmt wurde dieses Verhältnis mittels hochaufgelöster 2D-NMR-Verfahren. Für die Strukturaufklärung war im HMBC Experiment eine 3 J-Korrelation vom Wasserstoff an C19 bzw. C3- Position zur Carbonylgruppe des DTPA- bzw. des TTHA entscheidend, die die hier angegebene Struktur des bis-steroid-funktionalisierten DTPA stützt. Eine Veresterung in Position C10 des Steroids, wurde nicht beobachtet. Eine Umkristallisation, um das Kristallwasser zu entfernen, wurde nicht vorgenommen. Bei der Synthese des Bis-Cholesteryl-DTPA-diester-Liganden wurde nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur ein Gel erhalten, welches sich als äußerst thermostabil erwies. Ab einer Temperatur von 100°C ging dieses Gel in eine homogene Lösung über. Die Komplexierung der Steroid-DTPA- und Steroid-TTHA-Liganden wurde aufgrund der ungenügenden Wasserlöslichkeit unter Zugabe von Ethanol (10-20 Vol %) im leicht basischen durchgeführt. Während der Komplexierung wurde ein Niederschlag beobachtet der bei steigendem pH-Wert stärker wurde. Die Dichte des gebildeten Niederschlags war niedriger als die von Wasser, deshalb ist davon auszugehen, dass während der Komplexierung die Esterbindungen hydrolysieren und das entsprechende Steroid gebildet wird. Die Darstellung der koordinativen SteroidTTHA-Gd-Verbindungen wurde in einer Ethanol/Wasser-Mischung (1:4) durchgeführt. Bei einem stabilen pH-Wert von 5,5 wurde die Lösung entsalzt, da in Folge einer Deprotonierung bei höheren pH-Werten der einfach negativ geladene Komplex auf Ionenaustauschermaterialien beim Entsalzungsschritt verbleibt. Eine säulenchromatographische Trennung von Mono- und Bisaddukt blieb aufgrund der schlechten Löslichkeit der steroidalen-DTPA-Liganden als auch der Komplexe in organischen Lösungsmitteln wie Chloroform, Ether, Dichlormethan, erfolglos. In Ethanol/Wassermischungen (2:3) konnte im Falle des Bis-Hydrocortison-DTPA-GdKomplexes mittels Dünschichtchromatographie eine Trennung erzielt werden. Der Ergebnisse und Diskussion 41 Abstand der beiden Fraktionen betrug Rf=0,08. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es möglich ist, diese Bis-steroidalen-DTPA-diester-Gd(III)-Komplexe zu erhalten. Eine Separation vom gebildeten Monoaddukt-Komplex war mit klassischen Methoden wie Umkristallisation oder Säulenchromatographie nicht möglich. Eine Hydrolyse der Steroidliganden wird in den entsprechenden Amid bzw. HydrazidVerbindungen verhindert werden, weshalb das nicht beschriebene Cholesterylhydrazin hergestellt wurde. 4.4 Bestimmung der T1-Zeiten der Steroid-TTHA-diester-Gd(III)-Komplexe Aufgrund der schlechten Löslichkeit des Komplexes in Wasser wurde eine eluierende Komponente (DMSO 20-Vol-%) zugesetzt. Die homogenen Lösungen waren 1mmol/l konzentriert. Die T1-Zeiten dieser Lösungen wurden mittels Inversion Recovery Messungen bei 8,46T bestimmt (Tab. 7). Es ist zu erkennen, dass die T1-Zeiten dieser Steroid-TTHA-Gd(III)-Komplex-Lösungen im Vergleich zu reinem Wasser deutlich verkürzt sind und zu DTPA-diester-Komplex-Lösungen diese T1- Zeitverkürzung deutlich geringer ausfällt. [62, 63] In den Artikeln von Ruloff et al. werden die Röntgenstruktur und die paramagnetischen Eigenschaften des [Gd(TTHA)]3- sowie bestimmter TTHA-bisamid-Gd(III)-Komplexen beschrieben (Abb.17). [63] Gd Abb.17 Röntgenstruktur des TTHA-Gd(III)-Komplexes von Ruloff et al.[63] Anhand der Kristallstruktur in Abb. 17 ist zu erkennen, dass eine Koordination einer terminalen Aminodiacetat Einheit nicht gegeben ist. Die Koordinationszahl am Gd(III)-Zentralion ist neun, wobei im Kristallverbund sieben Koordinationsstellen durch funktionelle Gruppen des TTHA-Liganden besetzt sind. Die restlichen zwei koordinativen Bindungen werden intermolekular durch den Liganden der nächsten Ergebnisse und Diskussion 42 Gd(TTHA)-Einheit erzeugt. In wässriger Lösung wird von Ruloff et al. postuliert, dass zwei Koordinationstellen durch zwei Wassermoleküle ersetzt werden. Die Stabilitäten vom [Gd(TTHA]3--Komplex sind von Anderegg et al. [57] bestimmt worden. Sie sind trotz der größeren Anzahl an möglichen Koordinatiosstellen, kleiner als vom [Gd(DTPA]2--Komplex. Die hergestellten steroidalen TTHA-diester-Gd-Komplexe sind sterisch anspruchsvoller und besitzen ein wesentlich größeres Molekulargewicht. Erkennbar ist zudem, dass mit steigender Lipophilie der verwendeten Steroide (Hydrocortison, Prednison, Dexamethason, Cortison) der Einfluss der entsprechenden DTPA-Gd(III)-Komplexe auf die T1-Zeiten des Wassers abnimmt. Bei Betrachtung der gemessen bzw. berechneten Log P-Werte ist ein ähnlicher Trend wieder zu erkennen. Die Log P-Werte sind auch für andere Steroide in diesen Arbeiten angegeben. Dexamethason 1,92[93, 94]> Hydrocortison 1.4[93]> Cortison (berechnet) 1.2[93] Ergebnisse und Diskussion 43 T1 (longitudinale Relaxationszeiten [ms] / R1 (molare Relaxivitäten) [mmol/s] Bis-(Hydrocortison)-DTPA-Gd-diester-Komplex 702±2,8 / 1,45±0,01 Bis-(Cortison)-DTPA-Gd-diester-Komplex 769±1,9 / 1,30±0,00 Bis-(Prednison)-DTPA-Gd-diester-Komplex 1036±24 / 0,97±0,02 Bis-(Dexamethason)-DTPA-Gd-diester-Komplex 1566±1,6 / 0,64±0,00 [Gd(HTHHA)×2H2O]2- bei 0,47T (20MHz)[63] 152 / 6,60 Tab.7 T1-Zeiten der Bis-corticosteroidalen-TTHA-Gd(III)-diester-Komplexe bei 8,5T bestimmt mittels halblgarithmischer Auftragung O O OH OHO O N O O N O O O O O OH OHO N N O O O O Gd3+ F F O O O O HO O N O O N O O O O O O OHO N N O O O O Gd3+ O O O O HO O N O O N O O O O O O OHO N N O O O O 3+ O O OH O HO O N O O N O O O O O OH OHO N N O O O O Gd3+ Ergebnisse und Diskussion 44 4.5 MR-Experimente an C6-Zellen mit Bis-Steroid-TTHA-Gd(III)-diesterKomplexen Die bereits beschriebene schlechte Wasserlöslichkeit der Diester-Gd(III)-TTHAKomplexe machte die Erstellung einer konzentrierten Stammlösung in DMSO erforderlich, wobei im Zellkulturmedium Volumenanteil von 0,05% DMSO enthalten war. Gurtovenko et al. beschreiben, dass DMSO das Aufnahmeverhalten von Ionen durch Zellen beeinflussen kann[31]. Nach 12 stündiger Inkubation wurden die Zellen drei Mal (1×5ml PBS, 2×Medium) gewaschen. Die Pellets wurden jeweils in einem Milliliter Kulturmedium resuspendiert und in ein Eppendorff-Gefäß überführt. Die mit Bis-steroidalen-TTHA-diester-Gd(III)-Komplexen für 12 Stunden inkubierten Zellen zeigen im Vergleich zur Kontrolle einen konzentrationsabhängigen T1-gewichteten Kontrast. (Abb.18) Erkennbar ist außerdem die T1-Kontrastierung bestimmter Regionen in den einzelnen Eppendorff-Gefäßen, die auf Zellverdichtungen (Zellhaufen) hindeuten. Aus den Arbeiten von Cabella et al. [67] ist bekannt, dass handelübliche MR-Kontrastmittel, wenn auch nur in sehr geringen Konzentrationen in die Zelle diffundieren, wobei dieser Effekt durch lipophilie Seitengruppen des GdKomplexes begünstigt ist. Außerdem wird in dieser Arbeit die Aufnahme von freien Gd3+-Ionen aus instabilen Gd-Chelatkomplexen durch Zellen beschrieben. Die Mineralocorticoid-Rezeptoren als auch Glucocorticoid-Rezeptoren befinden sich im Cytosol. Nach Substratbindung diffundiert der Enzym-Substratkomplex zum Nukleus und greift hier in die Proteinbiosynthese ein. [35, 36, 37] Die Übertragbarkeit dieses Mechanismus auf die bis-steroidalen TTHA-diester-GdKomplexe ist aufgrund des größeren Molekulargewichts fraglich. Aus der Arbeit von Lee et al. [11] ist jedoch ersichtlich, dass trotz Steroidfunktionalisierung eines DO3AGd-Komplexes mit RU486 einem Gestagenagonisten, eine Membrangängigkeit beobachtet wurde. Gestagenrezeptorbindungstudien zeigten eine im Vergleich zum natürlichen Substrat kleinere Affinität zu Gestagen-Rezeptoren im Zellkern. Die Arbeit von Lee et al. zeigt die Eigenschaft von Steroid-Gd-Komplexen, die Zellmembran zu durchdringen und an molekulare Targets zu binden. Ergebnisse und Diskussion 45 Abb.18 MR-Abbild eines Eppendorff-cup-Agarosegelphantom mit bissteroidalen TTHA-Gd(III)-diester-Komplexen inkubierten C6-Glioma Zellen erhalten durch Messung mit einer MDEFT-Sequenz[66] sowie eines vergrößerten Ausschnitts des gleichen Bildes auf der rechten Seite 5.0 Synthese von Bis-Phosphatidylethanolamido(DPPE)-DTPA-Gd(III)- Komplex und Bis-(DPPE)-TTHA-Ligand N N N N H N H O O O OH O OH O OH O O P O O P O O O O O O O O HO O O OH C15H31 C15H31 C15H31 C15H31 NH2 O O P O O O O O OH C15H31 C15H31 O N N N O OH O O O O O N N N N H N H O O O OH O OH O OH O O P O O P O O O O O O O O HO O O OH C15H31 C15H31 C15H31 C15H31 NEt3 NEt3 N N N N H N H O O O O O O P O O P O O O O O O O O HO O O OH C15H31 C15H31 C15H31 C15H31 O O O O Gd3+ + DMF 60°C unter N2 DMF 60°C unter N2 Eingehende Literatur- und Datenbankrecherchen nach der Zielverbindung blieben bis zu diesem Zeitpunkt erfolglos. Lediglich das Monoaddukt eines phospholipidgebundenen DTPA-Liganden ist bereits von Grant et al.[18] beschrieben aber nicht umfassend genug charakterisiert worden. Das beschriebene Monoaddukt Kontrolle 35μM PrednisonKomplex 20μM CortisonKomplex 35μM CortisonKomplex 20μM PrednisonKomplex Ergebnisse und Diskussion 46 wurde durch Reaktion von DPPE mit einem vierfach tert-butyl-geschützten DTPALiganden an der zentralen Carboxyl-Gruppe verknüpft. Die Reaktion von DTPABisanhydrid mit einem zweifachen molaren Überschuss an Dipalmitoylphosphatidylethanolamin wurde in trockenem DMF unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Das DPPE wurde freundlicherweise von der Lipoid® GmbH zur Verfügung gestellt. Nach Erwärmen bei 80°C unter Erhalt einer homogenen Lösung wurden zwei Äquivalente Triethylamin zugegeben. Die Charkterisierung des erhaltenen Liganden erfolgte mittels hochaufgelöster 1 H- und 13C-NMR-Spektroskopie in d6-DMSO unter Zugabe von wenig d5-Pyridin. Dabei wurde mittels eines HMBC-Experiments eine 3 J-Fernkorrelation der –CH2-Gruppe der Ethanolamin-Einheit des DPPE zur Carbonylgruppe des DTPA-Ligandensystems beobachtet. Die Komplexierung in Wasser und Ethanol/Wasser-Mischungen scheiterte aufgrund der Unlöslichkeit dieser Verbindung in Wasser. Die Darstellung der koordinativen Gadoliniumverbindung wurde in DMF unter Zugabe von drei Äquivalenten Triethylamin bei 60°C durchgeführt. Anschließend wurden alle flüchtigen Bestandteile entfernt und es wurde ein weißer amorpher Rückstand beobachtet. Durch Feststoffextraktion mit Chloroform wurde von den unlöslichen Bestandteilen getrennt. Die Chloroform-Phase wurde einmalig mit wenig Wasser ausgeschüttelt. Nach der Zugabe von Wasser wurden beide Phasen schaumig trübe und es konnte nur eine Interphase beobachtet werden. Die Phasentrennung setzte nach mehreren Stunden ein. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels im Ölpumpenvakuum und anschließendem Trocknen wurde ein weißer amorpher Feststoff erhalten. Die Löslichkeit dieses bipolaren Gd(III)-Komplexes in organischen Lösungsmitteln, macht diesen Liganden auch für andere Anwendungen interessant. In der Arbeit von Parac-Vogt et al.[19] wird über die Einlagerung von Bis- (Phenylalaninalkylesteramido)-DTPA-Gd-Komplexen in Micellen bestehend aus unterschiedlich veresterten Phospholipiden (z.B. DPPC) berichtet. Diese Eigenschaft dieser koordinativen Gd(III)-Verbindungen aufgrund ihrer lipophilen Alkylseitenketten in DPPC-Liposomen zu interkalieren ist folglich auch für Markierungsexperimente an Zellen interessant. Ergebnisse und Diskussion 47 6.0 Synthese des Bis-Normorphinamido-DTPA-Gd(III)-Komplex O OH OH H N H H O N N N O OH O O O O O O N HO O N N O HO O O OH O HO H N H HO O OH H N H OH O N HO O N N O HO O O OH O HO H N H HO O OH H N H OH N O O O O HO H N H HO N O N O O O OH H N H OH O O Gd3+ 2 + Die Darstellung der besagten Zielverbindung erwies aufgrund der hohen Kosten des Normorphins als schwierig. Es wurde im Milligrammaßstab gearbeitet. Zudem war das Normorphin mit einer weiteren hydrierten Morphin-Komponente (Normorphinan) ca. 5% verunreinigt, wie aus EI- und ESI-Massenspektren und NMR-Spektren zu erkennen war. Das Normorphin ist ein sterisch gehindertes sekundäres Amin, das zudem über eine vinylische und eine aromatische Hydroxy-Gruppe verfügt. Zur Vermeidung von Reaktionen an diesen beiden Gruppem wurde die Reaktion für 12 Stunden bei 70°C durchgeführt, um das thermodynamisch stabilste Produkt (DTPAAmid) zu erhalten. Ein- und zweidimensionale heteronukleare NMR-Experimente sowie ESI-MS/MS-Experimente belegten die Bildung dieses DTPA-Bisamids. Der Ester wurde nicht beobachtet. Hochaufgelößte HMBC-NMR-Experimente zeigten eine 3 J-CH-Fernkopplung vom Methinproton bzw. von der Alpha-CH2-Gruppe des Normorphins zur DTPA-Carbonylgruppe. Mögliche 4 J-Fern-Korrelationen von den aromatischen Wasserstoffen zur DTPA-Carbonyl-Gruppe waren auch nach Vergrößerung der Mischzeit von 60 auf 80μs nicht zu beobachten. Daraus läßt sich schliessen, dass der Ester nicht oder nur stark untergeordnet gebildet wird. Die Komplexierung wurde im Verhältnis Ligand/GdCl3×6H2O 1:1 in Wasser durchgeführt. Der Komplex der Zielverbindung wurde erhalten und für Zelluntersuchungen bzw. T1- bzw. T2 Relaxivitätsbestimmungen weiter verwendet. 6.1 T1-, T2-Relaxationszeiten des Bis-(Normorphin)-DTPA-bisamid-Gd(III)- Komplexes Die Bestimmung der T1- und T2-Relaxationszeiten ist notwendig, um im späteren Zellexperiment die Menge an angelagerten bzw. aufgenommenen Opiat- Ergebnisse und Diskussion 48 Kontrastmittel zu bestimmen. Da sich die Zellen während der MR-Messung in Zellkulturmedium befinden wurden T1- bzw. T2-Messungen auch in Medium durchgeführt. (Tab. 8) Im Zellkulturmedium befinden sich eine Vielzahl von Substanzen (Proteine, Salze, Aminosäuren) die das Relaxationsverhalten des Komplexes stark verändern. Es ist bekannt, [44] das funktionalisierte Kontrastmittel mit Serumproteinen wechselwirken können, wobei dieser Effekt für den verbesserten Transport bzw. für eine größere Verweildauer der Gd-Komplexe erwünscht ist. Die durchgeführten Relaxationsmessungen des opiatfunktionalisierten DTPA-Gd(III)- Komplexes zeigen eine starke Abhängigkeit der T1- als auch T2-Zeiten vom verwendeten Lösungsmittel.(Tab. 8) Die longitudinalen als auch die transversalen Relaxationszeiten sind bei gleicher Konzentration des Komplexes unterschiedlich stark verkürzt. Die T2-Zeit des Opiat-Gd-DTPA-Komplexes in Zellkulturmedien / 5% FCS gemessen, ist im zeitlichen Verlauf nicht konstant. Die halblogarithmische Auftragung der Integrale zur Wartezeit  , zeigt zunächst einen linearen Verlauf, der bei größeren -Werten zunehmend exponentiell verläuft. (siehe Tab. 8) Die Zunahme der Linienhalbwertsbreite während der Messung bestätigt den beobachteten Effekt, dass sich die T2-Relaxationzeit der Probe während der Messung verändert. Bei der Bestimmung der T2-Zeit der Probe opiat-Gd-DTPA-Komplex in Zellkulturmedium wurden deshalb neun von insgesamt 24 Messwerten berücksichtigt Die in Kulturmedium frisch vorbereitete Probe, zeigte nach mehreren Stunden ebenfalls eine vergrößerte T1-Zeit, was durch einen Zerfall des Gd-DTPA-Komplexes bzw. einer Proteinwechselwirkung des Komplexes in Zellkulturmedium zu erklären ist. Die wässrige Lösung des Kontrastmittels, zeigte auch nach mehreren Tagen keine Veränderung der longitudinalen Relaxationszeit. Deshalb wurde eine NMR-T1- Kinetik an einer frisch bereiteten Probe in Zellkulturmedium durchgeführt, die die zeitlich Zunahme der T1-Relaxationszeit bestätigte. Aus der Gesamtrelaxivität einer Schicht kann bei bekannter Zellzahl pro Well die Konzentration des bindenden Komplexes berechnet werden, vorausgesetzt die Relaxivität des Kontrastmittel in oder an der Zelle ist nicht stark verändert. Ergebnisse und Diskussion 49 T1[ms] Medium T1[ms] Wasser Bis-Normorphin-DTPA-Gd (Bo=4,7T) 136,8±1 Bis-Normorphin-DTPA-Gd (Bo=4,7T) 208,5±4,5 T2[ms] Medium T2[ms] Wasser Bis-Normorphin-DTPA-Gd (Bo=4,7T) 164±24 Bis-Normorphin-DTPA-Gd (Bo=4,7T) 166±10 Tab.8 T2-Relaxationzeiten vom Bis-(Normorphin)-DTPA-bisamid-Gd(III)-Komplex in Zellkulturmedium und Wasser 6.2 Zerfall des Bis-Normorphinamido-DTPA-Gd(III)-Komplexes in Zellkulturmedium Wie bereits im vorherigen Abschnitt erläutert, zersetzt bzw. lagert sich der GdKomplex an Proteine an, woraus eine zeitabhängige Vergrößerung der T1-Zeit sowie der T2-Zeit resultiert. (Abb. 19) Der Zerfall des Kontrastmittels im Medium geht der Freisetzung von Gd3+-Ionen einher. Die freigesetzten Gadoliniumionen können von Serumproteinen mit Hilfe von polaren Seitengruppen (Hydroxyl, Amino-Gruppen, Peptidgruppen) koordiniert werden oder von den inkubierten Zellen aufgenommen werden [67]. Im Medium liegt außerdem Na2CO3 bzw. NaHCO3 vor, welches das freigesetzte Gadolinium(III) als Ln(I) Ln(I) N O O O O HO H N H HO N O N O O O OH H N H OH O O Gd3+ N O O O O HO H N H HO N O N O O O OH H N H OH O O Gd3+ N O O O O HO H N H HO N O N O O O OH H N H OH O O Gd3+ N O O O O HO H N H HO N O N O O O OH H N H OH O O Gd3+ Ergebnisse und Diskussion 50 schwerlösliches Carbonat-Salz fällt. Zum Ende der Kinetik nach 29h wurde im NMRRöhrchen ein feiner weißer Niederschlag beobachtet, wobei es sich Gd2(CO3)3 handeln kann. Abb. 19 Relaxivitätsabfall in Gegenwart des Bis-Normorphinamido-DTPAGd(III)-Komplexes gemessen in Zellkulturmedium/5%FCS im zeitlichen Verlauf von ca. 29 Stunden Erkennbar ist an der Zerfallskurve, dass das Gleichgewicht in den ersten 250 Minuten schnell erreicht wird, wobei nur noch eine geringfügige Änderung im weiteren Verlauf zu beobachten ist. Die Gleichgewichtskonzentration liegt bei ca. 80% der Anfangsrelaxivität die nach ca. 1750 Minuten (ca. 29h) konstant war. Die erhaltenen Ergebnisse sind wichtig für eine Bewertung des beobachteten T1- Kontrasts in Bezug zur Rezeptorbindungsfähigkeit des Kontrastmittels im gemessenen MR-Abbild des Zellphantoms. 6.3 MR-Experimente an C6-Zellen inkubiert mit Bis-(Normorphinamido)- DTPA-Gd(III)-Komplex C6-Glioma sind leicht zu kultivieren und besitzen den μ-Opiat-Rezeptor[68]. Die Inkubation von konfluenten Schalen mit verschieden Kontrastmittelkonzentrationen wurde über 12h bei 37°C im Brutschrank durchgeführt. Dazu wurde das Medium komplett ausgetauscht und durch frisch angesetztes DMEM-Medium, welches das opiathaltige Kontrastmittel in verschiedenen Konzentrationen (35μmol/l, 25μmol/l, 15μmol/l, 5μmol/l und 0μmol/l) enthielt, ersetzt. Die Zellen waren nach der Ergebnisse und Diskussion 51 Inkubation vital, was durch einen Trypanblautest mikroskopisch belegt wurde. Nach zwei separaten Waschschritten mit Medium und PBS-Puffer wurden die Zellen mittels Trypsin/EDTA von der Oberfläche der Zellkulturschale abgelöst und in ein Zentrifugenröhrchen überführt. Die inkubierten Zellen wurden nicht gezählt, sodass das erhaltene MR-Bild (Abb. 21) nur als eine qualitative Aussage gewertet werden kann. Die mit Opiatkontrastmittel inkubierten Zellen, sind in den einzelnen Vertiefungen klar zu erkennen. Der deutliche konzentrationsabhängige Kontrastunterschied kann als eine Bindung des opiat-funktionalisierten DTPA-Gd(III)- Kontrastmittels an C6-Zellen gedeutet werden. Jedoch wurde durch die kinetischen Messungen in Zellkulturmedium belegt, dass der Komplex in Zellkulturmedium thermodynamisch und kinetisch labil ist bzw. an Proteine bindet. Der GdKomplexzerfall geht wie im vorherigen Abschnitt erläutert, mit einer Freisetzung von Gd3+-Ionen einher. Die inkubierten Zellen können das Gleichgewicht zugunsten des Komplexzerfalls beeinflussen. Zudem verändern die Zellen im Verlauf der Inkubation die Zusammensetzung des Mediums (pH-Wert, Glukose/Laktat und AminosäureKonzentration), wodurch der Zerfall des Komplexes begünstigt wird. Zudem kann die Geschwindigkeit des Komplexzerfalls (Abb.20) durch den eben beschriebenen Effekt beeinflusst werden. Zellen, die freie Gadoliniumionen aufgenommen haben, zeigen im MR-Bild ebenfalls einen T1-Kontrast. Gd3+ KM Liganden + Protein Gd3+-Protein Zellen Abb.20 Zerfall des Opiatkontrastmittels Es ist zu berücksichtigen, dass die Kinetik in Medium mit einer vergleichsweise hohen Konzentration 1mmol/l an Kontrastmittel, während die Zelluntersuchungen mit sehr niedrigen Konzentration (35μmol/l) durchgeführt wurden. Ergebnisse und Diskussion 52 Abb.21 Agarose-Gel-Phantom mit Bis-Normorphinamido-Gd(III)-DTPA-Komplex inkubierten C6-Glioma-Zellen gemessen mit einer 3D-GEFI-MRPulssequenz 7.0 Synthese von Cyclen-Ligandensystemen Aufgrund gezeigten kinetischen thermodynamischen Labilität von funktionalisierten DTPA-Gd(III)-Komplexen, wurden derivatisierte Cyclen (1,4,7,10- Tetraazacyclododekan) Ligandensysteme wie 1,4,7,10-TetraazacyclododekanN,N´,N´´-tris-essigsäure-tert-butylester (DO3A) bzw. 1,4,7,10-TetrazacyclododekanN,N´,N´´-tris-essigsäure-tert-butylester-N´´´-methylessigsäureglycinamid (DOTA-Gly) verwendet. Das DO3A wurde am Max-Planck-Institut für Molekulare Kybernetik in Tübingen unter Leitung von Prof. Logothetis und Prof. Ugurbil während eines vier wöchigen Forschungsaufenthaltes selbst synthetisiert. Das DOTA-Gly wurde freundlicherweise von der Bayer/Schering AG von Herrn Dr. Schmitt-Willich zur Verfügung gestellt. Komplexe dieser Ligandensysteme zeichnen sich durch eine größere kinetische und thermodynamische Stabilität verglichen mit Ergebnisse und Diskussion 53 den offenkettigen Liganden wie DTPA aus. Bei den Umsetzungen des DOTA-Gly ist eine Aktivierung mittels DCCI, TBTU an der ungeschützten Carboxyl-Gruppe notwendig. Der Aktivester reagiert dann mit primären und sekundären Aminogruppen zum gewünschten Carbonsäureamid. 7.1 Umsetzung von DOTA-Me-Glycinamid (1,4,7,10-TetrazacyclododekanN,N´,N´´-tris-essigsäure-tert-butylester-N´´´-methylessigsäureglycinamid) mit 3,5-Bis-Trifluormethylbenzylamin N N N N O O O O O O O N H O HO N N N O NMe Me2N 2 BF4 DIPEA/DMF N N N N O O O O O O O N H O O N N N in situ NH2 CF3 F3C -TMH N N N N O O O O O O O N H O HN CF3 F3C N N N OH + + - + + Zu einem Äquivalent DOTA-Gly gelöst in einem Milliliter trockenem DMF unter Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur wurde equimolar TBTU zugegeben und unter Zugabe von DIPEA (Diisopropylethylamin) die Aktivierung gestartet. Die Lösung verfärbte sich innerhalb weniger Minuten braun. Nach 15 Minuten wurde das polytrifluormethylierte Benzylamin zugegeben und 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. ESI-Massenspektren zeigten die Bildung des Produkts neben vielen Verunreinigungen wie DO3A, 1,4,7,10-Tetrazazyklododekan-N-tert-butyl-N´,N´´,N´´´- trisessigsäure-tert-butylester an, die nach eingehender Untersuchung nur aus dem DOTA-Gly stammen können. 7.2 Umsetzung von DOTA-Me-Glycinamid (1,4,7,10-TetrazacyclododekanN,N´,N´´-tris-essigsäure-tert-butylester-N´´´-methylessigsäureglycinamid) mit Normorphin N N N N O O O O O O O N H O HO N N N O NMe Me2N 2 BF4 DIPEA/DMF N N N N O O O O O O O N H O O N N N in situ -TMH N N N N O O O O O O O N H O HO H O OH N H N N N OH O OH OH H N H H + + - + + Nach Darstellung des Aktivesters mit TBTU in situ wurde equimolar DPPE zugesetzt. Reaktionsverlaufskontrollen mittels ESI-Massenspektrometrie zeigten keine Produktbildung an. Auch das Erwärmen auf 60°C für 12 Stunden brachte keinen Erfolg. Ergebnisse und Diskussion 54 7.3 Umsetzung von DOTA-Methyl-Glycinamid (1,4,7,10-TetrazacyclododekanN,N´,N´´-tris-essigsäure-tert-butylester-N´´´-methylessigsäureglycinamid) mit DPPE (Dipalmitoylphosphatidylethanolamin) N N N N O O O O O O O N H O HO N N N O NMe Me2N 2 BF4 DIPEA/DMF N N N N O O O O O O O N H O O N N N in situ -TMH N N N N O O O O O O O N H O NH O P O O O O O OH O C C15H31 15H31 N N N OH H2N O P O O O O O HO O C15H31 C15H31 + + - + + Nach TBTU-Aktivierung wurde Dipalmitoylphosphatidylethanolamin im equimolaren Verhältnis zum Reaktionsgemisch gegeben und 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Reaktionskontrollen mittels ESI-Massenspektrometrie zeigten keine Produktbildung an. Auch das Erwärmen auf 60°C für 24 Stunden brachte keinen Erfolg. 7.4 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-tris-essigäure-tert-butylester (DO3A)[71] N N N N O O O O O O H N N N N H H H H K2CO3/CH3CN/RT/12h O O Br -KBr -CO2 -H 2O + Die Darstellung des geschützten DO3A-Systems erfolgte anhand einer leicht modifizierten Synthesevorschrift von Dadabhoy et al.[71]. Es wurde ein Äquivalent 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan mit drei Äquivalenten Bromessigsäure-tert-butylester und wasserfreiem K2CO3 bei -15°C in trockenem Acetonitril in großer Verdünnung umgesetzt und die Temperatur für 2 Stunden gehalten. Bereits nach kurzer Zeit bildete sich ein weißer Niederschlag, der auf die gebildeten Zwischenprodukte der Mono- und Bisalkylierung zurückzuführen ist. Das Reaktionsgemisch wurde noch weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt und im Anschluss wurde das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat am Rotationsverdampfer vollständig eingeengt. Der erhaltene ölige Rückstand wurde so oft in Toluol aufgeschlämmt bis kein tetrasubtituiertes Produkt mittels ESIMassenspektrometrie und 1 H-NMR-Spektroskopie mehr nachzuweisen war. Ergebnisse und Diskussion 55 Die Verbindung wurde mittels NMR-Spektroskopie und Massenspektrometrie charakterisiert. 7.5 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N´,N´´,-tris-essigäure-tert-butylesterN´´´-ethylalkohol (DO3A-EAlk) N N N N O O O O O O H N N N N O O O O O O OH I OH K2CO3/CH3CN/RT/12h -KI -CO2 -H2O + In trockenem Acetonitril wurde DO3A mit 2-Iodethanol unter Stickstoffatmosphäre im equimolaren Verhältnis für vier Stunden unter Rückfluss gekocht. Reaktionskontrollen mittels ESI-MS zeigten die Bildung des Produkts an, jedoch war auch noch sehr viel Edukt in der Probe enthalten. Die erneute Zugabe von 2- Iodethanol im 5 fachen Überschuss ergab keine Veränderung der Produktverteilung. Eine chromatographische Aufreinigung über Silikagel (Laufmittel Dichlormethan mit 5% Methanol) brachte auch nach schrittweiser Erhöhung des Methanolanteils keine Trennung. Die Zielverbindung unterscheidet sich zu dem bereits auf dem Markt befindlichen ProHance® [72] nur durch eine Methylgruppe an der Hydroxyethylgruppe (Hydroxyisopropylgruppe). Diese Verbindung sollte mit Hilfe von Carbonsäureanhydriden und p-Toluolsulfonsäurechlorid verestert werden. Ergebnisse und Diskussion 56 7.6 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N´,N´´,-tris-essigäure-tert-butylesterN´´´-essigsäuremethylester (DOTA-OMe)[97] N N N N O O O O O O O OMe O Br OMe -KBr -CO2 -H 2O N N N N O O O O O O H + K2CO3/CH3CN/RT/12h Die Alkylierungsreaktion von DO3A mit Bromessigsäuremethylester wurde in Gegenwart von wasserfreien Kaliumcarbonat in trockenem Acetonitril durchgeführt. Der erhaltene Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und von den unlöslichen Bestandteilen getrennt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde der erhaltene Feststoff über Silikagel mit dem Laufmittel (Dichlormethan/Methanol 95:5) chromatographiert und das gewünschte Produkt, das mit wenig DO3A verunreinigt war, erhalten. Die erhaltene Verbindung ist ein entscheidendes Zwischenprodukt für die Darstellung der 1,4,7,10-Tetraazacyclododekan-N,N´,N´´- tris-essigsäure-tert-butylester-N´´´-essigsäure, welches durch Esterhydrolyse mit LiOH in wässrigen Methanol dargestellt wird. In mehreren Testreaktionen wurde versucht den DOTA-Methylester mit Hydrazinen (Phenylhydrazin, Hydralazin) in Methanol unter Rückfluss für mehrere Stunden zu den betreffenden Hydraziden umzusetzen. In beiden Reaktionen wurde kein Umsatz festgestellt. 7.7 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-tris-essigsäure-tert-butylester-10- essigsäure-tert-butylcarbamoylhydrazids (DOTA-Hydra-Boc) N N N N O O O O O O O N H N H O O O Br NH HN O O -KBr -CO2 -H 2O N N N N O O O O O O H N N N N O OH O HO OH O O N H NH2 CF3COOH/H 2O/ TIPS -CO2 + -4 K2CO3 /CH3CN/RT/12h Die Alkylierungsreaktion von DO3A in trockenem Acetonitril unter Zugabe 1,1 Äquivalenten N-Bromacetyl-N´-tert-butylcarbamoyldihydrazid[81-83] wurde für 48 Stunden bei erhöhter Temperatur durchgeführt. Das Produkt kann an der HydrazidGruppe deprotoniert werden und bildet in Gegenwart von Kaliumcarbonat in Ergebnisse und Diskussion 57 wasserfreier Umgebung das Kaliumsalz. Dieses Ergebnis wird durch die Arbeit von Chekanova et al. [84]. über Bishydrazide bestätigt. Bis-Acylhydrazine sind schwach saure Verbindungen mit einem pKa-Wert zwischen 9-10. Diese Eigenschaft wurde bei der Synthese des geschützten DOTA-hydrazid-Liganden für die Trennung ausgenutzt. Die Löslichkeit des geschützten DOTA-Hydrazid-Kalium-Salzes in halogenierten Lösungsmitteln ist stark begrenzt, sodass bei der säulenchromatographischen Aufreinigung zunächst mit Dichlormethan mit unterschiedlichem Methanolanteil (bis 10%) chromatographiert wurde. Auf diesem Weg wurde vom nicht umgesetzten DO3A getrennt (33% des Eduktes wurden isoliert). Im Anschluss wurde die Säule mehrmals mit reinem Methanol gespült und diese Methanolfraktion am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde mit Essigsäure angesäuert und mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten ChloroformPhasen wurden mehrmals mit Wasser ausgeschüttelt und über Molekularsieb 4Å getrocknet. Das erhaltene Produkt wurde weiter umgesetzt. In der Arbeit von Frullano et al. [72, 73] wird parallel zu dem oben beschriebenen entwickelten Synthesekonzept ein weiterer Darstellungsweg der Zielverbindung vorgestellt und die Effektivität dieses Synthesebausteins für das „pre-Loading“- Konzept anhand der Umsetzung von Doxorubicin mit dem DOTA-Hydrazid-GdKomplex zum DOTA-Gd(III)-Hydrazid-Doxorucin-Komplex gezeigt. Die von Frullano et al. [72, 73] verfolgte Synthese zum DOTA-Gd(III)-HydrazidBausteins verläuft über den DOTA-Ethylester (Abb. 22), der im Anschluss mit Hydrazinmonohydrat für 16h in Methanol unter Rückfluss gekocht wird. Nach Abspaltung der tert-Butylgruppen und dem Komplexieren mit GdCl3 wurde der GdDOTA-Hydrazid-Komplex erhalten. Interessanterweise liegt im Doxorubicin ein ähnliches Strukturfragment (rot eingezeichnet) wie im Fall der Glucoco- bzw. Mineralocorticoide in C17-Position vor, welches als Ansatz zur Verknüpfung dieser Steroidklasse gesehen werden kann. Ergebnisse und Diskussion 58 N N N N O O O O O O O OEt O Br OEt -KBr -CO2 -H 2O N N N N O O O O O O H N N N N O OH O HO OH O O N H NH2 konz. HCl N2H4/ MeOH N N N N O O O O O O O N H NH2 GdCl3 N N N N O O O O O -O O N H NH2 Gd3+ OH O NH2 O O O OH OH OH O OH OMe MeOH -H2 O HO O H2N O O O HO OH HO N HO MeO N N N N O O O O O -O O N H Gd3+ + -3 + K2CO3 /CH3CN/RT/12h Abb.22 Synthese eines DOTA-Doxorubicin-Gd(III)-Komplexes verknüpft über eine Hydrazidbrücke nach Fraullano et al.[72] Der Sytheseansatz der Hydrazidverknüpfung biologisch aktiver Strukturen an Polypeptide wurde von Leamon et al. [74, 75] verfolgt. Dazu wurde ein Dekapeptid an der N-terminalen Gruppe mit Folsäure umgesetzt und an der C-terminalen Gruppe mit Vinblastinhydrazon verknüpft. Diese Substanz zeigte bei der Behandlung von Ratten mit Ovarialcarcinomen nach Applikation hohe Therapieerfolge, da diese Verbindung an Folsäurerezeptoren der Ovarialcarcinoma-Zellen bindet und gleichzeitig mit dem Zytostatikum Vinblastin verknüpft ist. Der Vorteil dieses DOTA-Gd(III)-Komplexbausteins liegt in der gezielten Einführung von Gd(III)-DOTA-Einheiten in biologisch aktive Verbindungen (Corticoide, Zytostatika u.v.m.). Berücksichtigt werden muss jedoch die Hydrolyselabilität der Acylhydrazon-Bindung mit der Rückreaktion zum Komplexbaustein und zum entsprechenden Keton. Zusammenfassung und Ausblick 59 8.0 Zusammenfassung und Ausblick Substanz T1 (8,5T)[ms] Charakterisierung Durchgeführte Experimente Bis-Hydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexe Bis-(phenylhydrazido)-DTPA-Gd(III)- Komplex 284,2±1,9 1 H-, 13C-NMR ESI-MS -EPR-Messungen zeigten das keine Radikale im Festkörper vorliegen -kinetische Messung der Transmetallierung des Gd-Komplexes mit Zn2+- Ionen mit dem Ergebnis, dass Bis-hydrazid-DTPAGd(III)-Komplexe instabiler sind als DTPAbisamid-Gd-Komplexe Bis-(2,4-dinitrophenylhydrazido)- DTPA-Gd(III)-Komplex 70,0±1,0 1 H-, 13C-NMR ESI-MS Bis-(phenylhydrazido)-DTPA-Gd (III)-Komplex 284,2±1,9 1 H-, 13C-NMR ESI-MS Fluorierte DTPA-Gd(III)-Komplexe Bis-(4-fluorbenzylamido)-DTPAGd(III)-Komplex 1 H-, 13C-NMR ESI-MS -Bestimmung der 1 H-T1- und 19F-T1-Zeiten (in rot dargestellt) ausgewählter fluorierter Gd-DTPAKomplexe und Liganden -Temperaturabhängige 19F-NMR-Messungen des Bis-(3,5- Trifluormethylbenzylamido )-DTPA-Gd(III)- Komplexes zeigten eine temperaturabhängige chemische Verschiebung 19F-NMR-Signals - 19F-MR-Experimente verliefen negativ Bis-(3,5-Trifluormethylbenzylamido)- DTPA-Gd(III)-Komplex 149,4±0,8 206±24 1 H-, 13C-NMR ESI-MS Bis-(3,5-Trifluormethylbenzylamido)- DTPA-Ligand1 1481±38 1 H-, 13C-NMR ESI-MS Bis-(3,5-Trifluormethylbenzyl)- DTPA-Gd(III)-diester2 -Komplex 1 H-, 13C-NMR ESI-MS N N N O O O O N H N H O O CF3 F3C F3C CF3 O O Gd3+ N N N O OH O O N H N H O OH O OH CF3 F3C F3 C CF3 N N N O O O O N H N H N N H H O O O O Gd O2 N 3+ O2 N NO2 NO2 N N N O O O O N H N H N N H H O O O O Gd3+ N N O O N O O N H N H O O O O Gd3+ F F N N N O O O O N H N H O O CF3 F3 C F3 C CF3 O O Gd3+ N N N O O O O N H N H N N H H O O O O Gd3+ Zusammenfassung und Ausblick 60 Substanz T1 (8,5T)[ms] Charakterisierung Steroid-DTPA- und TTHA-Gd(III)-diester-Komplexe Bis-(Cortison)-DTPA-Gd(III)- diester-Komplex 769±1,9 1 H-, 13C-NMR, HSQC, HMBC, HHCOSY, ESI-MS -MR-Experimente an inkubierten Zellen zeigten einen konzentrationsabhänBis-(Dexamethason)-DTPA-Gd- gigen T1-Kontrast diester-Komplex 1566±1,6 1 H-, 13C-NMR, HSQC, HMBC, HHCOSY, ESI-MS Bis-Androsteron-DTPA-Gd(III)- diester-Komplex - 1 H-, 13C-NMR, HSQC, HMBC, HHCOSY, ESI-MS Bis-Lithocholsäure-DTPA-Gd(III)- diester-Komplex - 1 H-, 13C-NMR, HSQC, HMBC, HHCOSY, ESI-MS Bis-Cortison-DTPA-Gd(III)-diesterKomplex - 1 H-, 13C-NMR, HSQC, HMBC, HHCOSY, ESI-MS Bis-Cortisol-DTPA-Gd(III)-diesterKomplex - 1 H-, 13C-NMR, HSQC, HMBC, HHCOSY, ESI-MS Bis-Cholesterin-DTPA-Gd(III)- diester-Komplex - ESI-MS O O OH O HO O N O O N O O O O O OH OHO N N O O O O Gd3+ F F N O O O O N O O N O O O O Gd3+ N O O O N O N O O O O Gd3+ O O O HO OH O O O HO OH N O O O N O N O O O O Gd3+ O O O O OH O O O HO O N O O O N O N O O O O Gd3+ O CH3 CH3 H OH O H H H O CH3 CH3 H HO O H H H N O O O N O N O O O O Gd3+ O CH3 CH3 H H H O CH3 CH3 H H H O O O O O O HO O N O O N O O O O O O OHO N N O O O O Gd3+ Zusammenfassung und Ausblick 61 Substanz T1 (8,5T)[ms] Charakterisierung Durchgeführte Experimente Steroid-DTPA- und TTHA-Gd(III)-diester-Komplexe Bis-Corticosteron-DTPA-Gd(III)- diester-Komplex - 1 H-, 13C-NMR, HSQC, HMBC, HHCOSY, ESI-MS Bis-Normorphinamido-DTPA-Gd(III)-Komplex Bis-Normorphin-DTPA-Gd (Bo=4,7T) (Medium) 136,8±1 1 H-, 13C-NMR, HSQC, HMBC, HHCOSY, ESI-MS -Langzeit-T1-Messung in Zellkulturmedium zeigt einen Zerfall des Kontrastmittels bzw. eine Anlagerung an Proteine -MR-Untersuchungen an inkubierten Zellen zeigten einen konzentrationsabhängigen T1-Kontrast Bis-Normorphin-DTPA-Gd (Bo=4,7T) (Wasser) 208,5±4,5 1 H-, 13C-NMR, HSQC, HMBC, HHCOSY, ESI-MS Bis-(Dipalmitoylphosphatidylethanolamido(DPPE))-Liganden und Komplexe Bis-(Dipalmitoylphosphatidylethanolamido(DPPE))-DTPAGd(III)-Komplex 1 H-, 13C-NMR, HSQC, HMBC, HHCOSY, ESI-MS -Die Liganden wurden dargestellt, dabei ist anzumerken, dass der mit DPPE funktionalisierte DTPAGd(III)-Komplex in CHCl3 löslich ist. Bis- (Dipalmitoylphosphatidylethanolami do(DPPE))-TTHA-Liganden 1 H-, 13C-NMR, HSQC, HMBC, HHCOSY, ESI-MS N O O O O HO H N H HO N O N O O O O H N H OH O O Gd3+ N N N N H O O OH O OH O OH O O P O O O O C 15H 31 O OH C 15H 31 N H O O P O O O O O C 15H 31 O C 15H 31 N HO O OH N N N N H N H O O O O O O P O O P O O O O O O O O HO O O OH C15H31 C15 H31 C15H31 C15H31 O O O O Gd3+ N O O O N O N O O O O Gd3+ O O O HO O O O OH N O O O O HO H N H HO N O N O O O OH H N H OH O O Gd3+ Zusammenfassung und Ausblick 62 Substanz T1 (8,5T)[ms] Charakterisierung Durchgeführte Experimente Auf Cyclen (1,4,7,10-Tetraazacyclododekan) basierende Ligandensysteme DO3A (1,4,7,10- Tetraazacyclododecan-N,N´,N´´- trisessigsäure) 1 H-, 13C-NMR, HSQC, HMBC, HHCOSY, ESI-MS -Ausgangs-verbindung wurde nach der Methode von Dadaboy et al. dargestellt. DOTA-Boc-hydrazid (1,4,7,10- Tetraazacyclododecan-N,N´,N´´-trisessigsäure-tert-butylester-N´´´- essigsäure tertbutylcarbamoyldihydrazid) NMR-Experimente aufgrund der großen Dynamik schwierig auszuwerten! ESI-MS HR-MS -Das DOTA-Bochydrazid wurde parallel zu den eigenen Arbeiten von Frullano et al. auf einem anderen Syntheseweg dargestellt. Reaktionen des DOTAOMe-Esters mit verschieden Hydrazinen scheiterten. DOTA-EAlk (1,4,7,10- Tetraazacyclododekan-N,N´,N´´,- tris-essigsäure-tert-butylester-Nethylalkohol) NMR-Experimente aufgrund der großen Dynamik schwierig auszuwerten! ESI-MS HR-MS 1,4,7,10-TetraazacyclododekanN,N´,N´´,-tris-essigsäure-tertbutylester-N-ethylessigester NMR-Experimente aufgrund der großen Dynamik nicht auszuwerten! ESI-MS HR-MS Tab.9 Alle synthetisierten Gd-Komplexe bzw. Liganden mit Parametern zur Übersicht Die Darstellung von Bis-Hydrazid-Gd-DTPA-Komplexen verläuft in guten Ausbeuten. Die Relaxivität dieser Bis-Hydrazid-Gd(III)-DTPA-Komplexe wird von sterischen und elektronischen Effekten der Substituenten beeinflusst. Die kinetische Stabilität gegenüber der Transmetallierungsreaktion mit Zn2+-Ionen ist gering, wie Langzeit-T1- Messungen belegen. Festkörper EPR-Messungen des Bis-(2,4- N N N N O O O O O O H N N N N O O O O O O OH N N N N O O O O O O O N H N H O O N N N N O O O O O O O CH3 O Zusammenfassung und Ausblick 63 Dinitrophenylhydrazido)-DTPA-Gd(III)-Komplexes und Bis-Phenylhydrazido-DTPAGd(III)-Komplexes zeigen, dass kein Radikal im Festkörper vorliegt und die Farbänderung während der Komplexierungsreaktion des Bis-(2,4- Dinitrophenylhydrazido)-DTPA-Gd(III)-Komplexes durch eine Deprotonierung der Hydrazid-Gruppe und die anschließende Delokalisation der Ladung im aromatischen Sechsring zu erklären ist. Die Erhöhung der Lipophilie, die für Zellmarkierungsexperimente wichtig ist, wurde durch die Einführung von Phosphatidylethanolamin, Steroiden (Dexamethason, Androsteron, Cortison, Hydrocortison, Cholesterin, Prednison, Lithocholsäure, Corticosteron) aber auch mit Hilfe von fluorierten und polyfluorierten Substraten erreicht. Die Einführung von Corticoiden beinhaltet neben einer Lipophilieerhöhung auch einen rezeptorbindenden Ansatz (GCR-Rezeptor bzw. MR-Rezeptor). Aufgrund der geringen Stabilität der bisubstituierten DTPA-Gd-Komplexe wurde das bisher kaum untersuchte Ligandensystem TTHA mit Steroiden funktionalisiert. Das bissubstituierte TTHA-Ligandensystem besitzt acht Koordinationsstellen im Vergleich zu sechs Koordinationsstellen beim bis-subtituierten DTPA-Ligandensystem. Die T1- Zeitbestimmungen der bis-funktionalisierten TTHA-Gd(III)-Komplexe in einem Wasser/DMSO-Gemisch zeigten eine Vergrößerung der longitudinalen Relaxivität des Wassersignals, die im Vergleich zu wässrigen Proben von DOTA- und DTPAGd(III)-Komplexen erheblich kleiner ist. Zellmarkierungsversuche mit dem BisCortison-TTHA-diester-Gd(III)- und Bis-(Prednison)-TTHA-diester-Gd(III)-Komplex zeigten unterschiedlich starken T1-Kontrast der C6-Glioma in Abhängigkeit von der Konzentration. Diese Untersuchungen ermöglichen keine Aussage über die Art der Bindung des Kontrastmittels an die Zelle. Das Kontrastmittel kann sowohl unspezifisch mit der Zellmembran interagieren als auch an den MR- oder GCRRezeptor binden. Es wurden polyfluorierte DTPA-Gd(III)-Komplexe dargestellt, die eine Verkürzung der 19F-T1-Zeit im Vergleich zum korrespondierenden Liganden aufwiesen. Für den Bis- (3,5-Bis-Trifluoromethylbenzylamido)-DTPA-Gd(III)-Komplex wurde eine temperaturabhängige Änderung der chemischen Verschiebung des 19F-NMR-Signals beobachtet. Die verkürzten 19F-T1-Zeiten als auch die temperaturabhängige Änderung der chemischen Verschiebung im 19F-NMR-Spektrum könnten für in vivo Temperaturmessungen und/oder eine kombinierte Fluor /Wasserstoffbildgebung genutzt werden können. Zusammenfassung und Ausblick 64 Die Einführung des Dipalmitoylphosphatadylethanolamins (DPPE), eines Hauptbestandteils von Zellmembranen in Ligandensysteme, verlief sowohl beim DTPA- als auch beim TTHA-Ligandensystem erfolgreich. Die Komplexierung des DPPE-DTPA-Liganden mit GdCl3 wurde durchgeführt und der Komplex erhalten. Eine potentielle Anwendung dieser Substanzklassen könnte der Einsatz als Palladiumpolycarboxylat-Phasentransferkatalysator[85, 86], sowie als Zytostatikum (mehrkerniger Pt-Komplex) für die Chemotherapie sein. Die Verknüpfung des DTPA-Liganden mit Normorphin und der Erhalt des GdKomplexes verliefen in guten Ausbeuten, sodass T1- und T2- Zeitmessungen in Wasser und Zellkulturmedium durchgeführt werden konnten. Diese Experimente zeigten eine vergleichbare Verkürzung der longitudinalen Relaxationszeit wie andere DTPA-bisamid-Komplexe. T1-Langzeitmessungen wiesen auf einen Zerfall der Komplexe bzw. eine Proteinbindung des Kontrastmittels im Medium hin. Anhand der im zeitlichen Verlauf zunehmenden Spin-Spin- und Spin-Gitter-Relaxationszeit konnte dieser Effekt verfolgt werden. Nach einer Gesamtmesszeit von 29 Stunden wurde die Kinetik-Messung beendet, wobei die Gleichgewichtskonzentration näherungsweise erreicht wurde, der Relaxivitätsendwert lag bei ca 80% des Anfangswertes. Eine zwölfstündige Inkubation von C6-Zellen mit dem opiatfunktionalisierten DTPAGd-Komplex zeigte im MR-Bild T1-kontrastierte Zellen. Die Stärke des beobachteten T1-Kontrasts ist konzentrationsabhängig und im MR-Bild deutlich zu erkennen. Es können anhand der vorliegenden Informationen keine Aussagen über Art der Bindung des Kontrastmittels an die Zelle getroffen werden. Die Anwendung für in vivo Experimente sollte sich auf Ligandensysteme mit höherer kinetischer Stabilität (DOTA, DO3A) beschränken. Trotzdem ist davon auszugehen, dass eine Rezeptorbindung vorliegt, da eine sterisch anspruchsvolle Funktionalisierung am NAtom des Normorphins unter Erhalt der Rezeptoraffinität möglich ist[76-80]. Opiatfunktionalisierte radioisotopenmarkierte DOTA-Kontrastmittel sind bereits in der Literatur beschrieben [28]. Durchgeführte Testreaktionen zur Opiatverknüpfung mit dem DOTA- und dem DO3A- Ligandensystem verliefen im Mikromaßstab erfolglos. Die Synthese von derivatisierten DOTA-Verbindungen wurde mit Hilfe der von der Fa. Schering zur Verfügung gestellten 1,4,7,10-Tetraazacyclododekan-N,N´,N´´- triessigsäure-tert-butylester-N´´´-iso-propionsäureglycinamid (DOTA-Me-Gly) und dem am MPI-Tübingen (Institut für molekulare Kybernetik) selbst dargestellten Zusammenfassung und Ausblick 65 1,4,7,10-Tetraazacyclododekan-N,N´,N´´-triessigsäure-tert-butylester (DO3A) durchgeführt. Die Problematik der Makrocyklenchemie besteht in der Aufreinigung bzw. Trennnung von Gemischen aus verschiedenen makrozyklischen Verbindungen (DOTA bzw. DO3A). Eine weitere Schwierigkeit ist die Aufnahme und Auswertung geeigneter NMR-Spektren, da der makrocyklische Ring eine temperaturabhängige Dynamik zeigt[87, 90, 95, 96]. Die Synthese eines Komplex-Synthesebausteins wurde weiter unter dem Aspekt der Hydrazid-Verknüpfung verfolgt. Umsetzungen des DOTA-Methylesters mit verschiedenen Hydrazinen führten auch bei langen Reaktionszeiten nicht zur Ausbildung von DOTA-Hydraziden. Experimenteller Teil 66 9.0 Experimenteller Teil: 9.1 Darstellung von DTPA-Bisanhydrid[83] O N N N O O OH O O O O HO N N N OH OH O O O O HO OH O Py/Ac2O - AcOH 393,4 g/mol C14H23N3O10 357,3 g/mol C14H19N3O8 Ausbeute: 6,56g (92% d. Th.) Smp.: 193°C In einem 50 ml Rundkolben mit Rührer und Rückflusskühler werden 7,87g (20mmol) Diethylentriaminpentaessigsäure vorgelegt. Es werden 10ml (120mmol) trockenes Pyridin und 8ml (85mmol) Essigsäureanhydrid zugegeben. Die Suspension wird 24h bei 60°C unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Der Rückstand wird abfiltriert und mehrmals mit trockenem Acetonitril und Diethylether gewaschen. Anschließend wird der farblose Feststoff im Ölpumpenvakuum getrocknet. 1 H-NMR(360MHz, D6-DMSO): t 2,59ppm (4H, -CH2), t 2,75 ppm (4H, -CH2), s 3,30ppm (2H, CH2 an COOH), s 3,71 ppm (4H Ring-CH2) 13C-NMR(360MHz, D6-DMSO): 171,9ppm (-COOH), 165,7ppm (C=O), 54,5ppm (CH2), 52,5ppm (CH2), 51,7ppm (CH2), 50,6ppm (CH2) ESI-MS (DMF): positiv: 737 [2M+Na]+ , 380 [M+Na]+ , 358 [M+H]+ negativ: 374 [M-H+H2O]- , 356 [M-H]- . 9.2 Darstellung von TTHA-Bisanhydrid[65] N N O O OH O O O N N O O O HO N N N OH OH O O OH O N O OH O OH O HO Py/Ac2O - AcOH 458,43 g/mol C18H26N4O10 494,4 g/mol C18H30N4O12 Ausbeute: 1,72g (74% d. Th.) Smp.: 175-178°C [Lit. 171-172°C][65] In einem 20ml Rundkolben mit Rührer und Rückflusskühler werden 2,5g (5,1mmol) Triethylentetraminhexaacetat vorgelegt. Es werden 2,5ml (30mmol) trockenes Pyridin und 2ml (21,3mmol) Essigsäureanhydrid zugegeben. Die Suspension wird 24h bei Experimenteller Teil 67 60°C unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Der braune Rückstand wird abfiltriert und mehrmals mit trockenem Acetonitril und Diethylether gewaschen. Anschließend wird der braune Feststoff im Ölpumpenvakuum getrocknet. 1 H-NMR (360MHz, D6-DMSO, T=35°C): 2,75 ppm (t, 4H, CH2), 2,76 ppm (t, 4H, CH2), 2,86 ppm (t, 2H, CH2 an COOH), 3,34 ppm (s, 8H CH2), 3,37 ppm (s, 4H, CH2) 13C-NMR (360MHz, D6-DMSO, T=35°C): 170,6 ppm (-COOH), 172,3 ppm (C=O im Ring), 50,7 ppm (CH2), 50,7 ppm (CH2), 51,65 ppm (CH2), 55,0 ppm (CH2), 54,7 ppm (CH2) ESI-MS(DMF): positiv: 398 [M+H2O+Na]+ , 380 [M+Na]+ , 358 [M+H]+ negativ: 374 [M-H+H2O]- , 356 [M-H]- 9.3 Allgemeine Synthese von Bis-Hydrazid-DTPA-Liganden In einem 50ml Rundkolben mit Magnetrührstäbchen und Anschützaufsatz werden 300mg (0,84mM) DTPA-Bis-Anhydrid in 10ml DMF (trocken) vorgelegt, auf 60°C erwärmt bis sich sämtliches DTPA-Bis-Anhydrid gelöst hat und die Lösung klar wird. Jetzt werden 2Äq (1,68mmol) Alkylhydrazin mittels einer Spritze bzw. als Feststoff zugegeben und weitere 4h bei 60°C gehalten. Alle flüchtigen Bestandteile werden im Ölpumpenvakuum entfernt. Es blieb ein öliger Rückstand zurück, der nach Erhitzen im Ölpumpenvakuum farblos mit DMF amorph auskristallisiert. Der Feststoff wird mit 2×10ml Chloroform gewaschen und 4h im Ölpumpenvakuum getrocknet. 9.4 Allgemeine Synthese von Bis-Hydrazid-DTPA-Gd-Komplexen In einem 200ml Erlenmeyerkolben werden 100mg Bis-Hydrazid-DTPA-Ligand in 50ml Wasser gelöst und danach 1 Äq. GdCl3×6H20 zugegeben. Die Komplexierung wird unter pH-Kontrolle verfolgt. Es wird mit 0,1M-NaOH auf pH=7 eingestellt und weitere 10min stehen gelassen und nochmals auf pH=7 eingestellt.* Mittels einer 20ml Spritze wird das Reaktionsgemisch aufgenommen und mit einer mit bidest. Wasser vorkonditionierten (QMA-Excell plus) Festphasenkartusche entsalzt und an einer Lyophille gefriergetrocknet. *Beim Bis-(2,4-Dinitrophenylhydrazido)-DTPA-Liganden setzt eine massive Farbveränderung von gelb zu dunkelrot ein. Bei den anderen Komplex-Titrationen Experimenteller Teil 68 trat jedoch keine Farbveränderung ein.(Die Lösungen bzw. die Feststoffe sind farblos) 9.5 Bis-Phenylhydrazid-DTPA-Ligand und Gd(III)-Komplex HN NH2 O N N N O OH O O O O O N N N O OH O O N H N H N N H H O OH O OH 2 + 108,14 g/mol C6H8N2 357,32 g/mol C14H19N3O8 573,61 g/mol C26H35N7O8 A usbeute: 404mg (84% d. Th) Smp.: 170°C 1 H-NMR(360MHz, D6-DMSO): breites t 3,01ppm (4H, DTPA-CH2), breites t 3,1ppm (4H, DTPA-CH2), s 3,39ppm (4H, DTPA-CH2), s 3,42ppm (4H, DTPA-CH2), s 3,48 ppm (2H, DTPA-CH2), m 7,09-7,17 ppm (10H, H-Aromat), breites m 9,40ppm (2H, NH), breites s 9,72ppm (2H, NH) 13C-NMR(360MHz, D6-DMSO): 50,1ppm (DTPA-CH2-Ethylen), 52,0ppm (DTPACH2-Ethylen), 53,3ppm (DTPA-CH2), 56,5ppm (DTPA-CH2), 57,3ppm (DTPA-CH2), 113,5ppm (C-Aromat), 119,7ppm (C-Aromat), 129,9ppm (C-Aromat), 150,6ppm (CAr), 170,6ppm (DTPA-CONH), 171,3ppm (DTPA-COOH), 174,1ppm (DTPA-COOH Zentral) ESI-MS(DMF): positiv m/z: 690 [M-2H+2Na+K]+ , 668 [M-H+Na+K]+ , 652 [M-H+2Na]+ , 646 [M+K]+ , 630 [M+Na]+ negativ m/z: 644 [M-2H+K]- , 628 [M-2H+Na]- , 606 [M-H]- Komplexierung: GdCl3 /H2 O/ NaOH NaCl N N N O OH O O N H N H N N H H O OH O OH N N N O O O O N H N H N N H H O O O O Gd3+ -3 727,86 g/mol C26H32GdN7O8 573,61 g/mol C26H35N7O8 Ausbeute: 121mg (96% d. Th.) Experimenteller Teil 69 Smp. 280°C unter Zersetzung ESI-MS(DMF): positiv m/z: 690 [M-2H+2Na+K]+ , 668 [M-H+Na+K]+ , 652 [M-H+2Na]+ , 646 [M+K]+ , 630 [M+Na]+ negativ m/z: 644 [M-2H+K]- , 628 [M-2H+Na]- , 606 [M-H]- 9.6 Bis-(2,4)-Dinitro-phenylhydrazido-DTPA-Ligand und Gd(III)-Komplex N H NH2 NO2 NO2 O N N N O OH O O O O O N N N O OH O O N H N H N N H H O OH O NO OH 2 O2N NO2 NO2 2 + 357,32 g/mol C14H19N3O8 198,14 g/mol C6H6N4O4 753,60 g/mol C26H31N11O16 Ausbeute: 589mg (93% d. Th.) Smp.: 120°C 1 H-NMR(360MHz, D6-DMSO): breites t 2,85ppm (4H, DTPA-CH2), breites t 3,1ppm (4H, DTPA-CH2), s 3,41ppm (4H, DTPA-CH2), s 3,51ppm (4H, DTPA-CH2), s 3,57ppm (2H, DTPA-CH2), breites s 9,68ppm (1H, NH-NH) 13C-NMR(360MHz, D6-DMSO): 51,2ppm (DTPA-CH2), 52,9ppm (DTPA-CH2), 55,6ppm (DTPA-CH2), 56,9ppm (DTPA-CH2), 66,2ppm (4H, DTPA-CH2), 79,1ppm (Cq-tert-butyl), 115,9ppm (C-Aromat), 123,1ppm (C-Aromat), 129,3ppm (C-Aromat), 129,8ppm (C-Aromat), 136,4ppm (C-Aromat), 148,4ppm (C-Aromat), 156,5ppm (COOtert-butyl), 169,1ppm (DTPA-COOH), 169,9ppm (CONH), 170,1ppm (DTPACOOH-Zentral) ESI-MS(DMF): positiv m/z: 690 [M-2H+2Na+K]+ , 668 [M-H+Na+K]+ , 652 [M-H+2Na]+ , 646 [M+K]+ , 630 [M+Na]+ negativ m/z: 644 [M-2H+K]- , 628 [M-2H+Na]- , 606 [M-H]- Komplexierung GdCl3 /H2 O/ NaOH NaCl N N N O OH O O N H N H N N H H O OH O OH O2N O2N NO2 NO2 N N N O O O O N H N H N N H H O O O O Gd O2N 3+ O2N NO2 NO2 -3 907,85 g/mol C26H28GdN11O16 753,60 g/mol C26H31N11O16 Experimenteller Teil 70 Ausbeute: 26mg (22% der Theorie) Smp.: 250°C Zersetzung ESI-MS(DMF): positiv m/z: 690 [M-2H+2Na+K]+ , 668 [M-H+Na+K]+ , 652 [M-H+2Na]+ , 646 [M+K]+ , 630 [M+Na]+ negativ m/z: 644 [M-2H+K]- , 628 [M-2H+Na]- , 606 [M-H]- 9.7 Bis-tert-butylcarbamoylhydrazido-DTPA-Ligand und Gd(III)-Komplex N H NH2 O O O N N N O OH O O O O O N N N O OH O O N H N H N N H H O OH O OH O O O O + 2 132,2 g/mol C5H12N2O2 357,3 g/mol C14H19N3O8 621,65 g/mol C24H43N7O12 Ausbeute: 428mg (82% d. Th.) Smp.: 260°C Zersetzung 1 H-NMR(360MHz, D6-DMSO): s 1,39ppm (s, 9H ), breites t 2,88ppm (4H, DTPACH2), breites t 3,0ppm (4H, DTPA-CH2), s 3,35ppm (4H, DTPA-CH2), s 3,45ppm (4H, DTPA-CH2), s 3,48ppm (2H, DTPA-CH2), breites s 9,68ppm (1H, NH-NH) 13C-NMR(360MHz, D6-DMSO): 29,3ppm (9H, CH3-tert-butyl), 51,2ppm (DTPA-CH2), 52,9ppm (DTPA-CH2-Ethylen), 55,6ppm (DTPA-CH2), 56,9ppm (DTPA-CH2), 66,2ppm (4H, DTPA-CH2), 79,1ppm (Cq-tert-butyl), 156,5ppm (COOtert-butyl), 170,2ppm (DTPA-COOH), 171,2ppm (CONH), 173,8ppm (DTPA-COOH) ESI-MS(DMF): positiv m/z: 690 [M-2H+2Na+K]+ , 668 [M-H+Na+K]+ , 652 [M-H+2Na]+ , 646 [M+K]+ , 630 [M+Na]+ negativ m/z: 644 [M-2H+K]- , 628 [M-2H+Na]- , 606 [M-H]- Komplexierung N N N O OH O O N H N H N N H H O OH O OH O O O O GdCl3 /H2 O/ NaOH NaCl N N N O O O O N H N H N N H H O O O O Gd3+ O O O O 621,65 g/mol C24H43N7O12 -3 778,90 g/mol C24H40GdN7O12 Experimenteller Teil 71 Ausbeute: 119mg (95% d. Th.) Smp.: 280°C Zersetzung ESI-MS(DMF): positiv m/z: 690 [M-2H+2Na+K]+ , 668 [M-H+Na+K]+ , 652 [M-H+2Na]+ , 646 [M+K]+ , 630 [M+Na]+ negativ m/z: 644 [M-2H+K]- , 628 [M-2H+Na]- , 606 [M-H]- 9.8 Bis-hydrazido-DTPA-Gd-Komplex N N N O O O O N H N H NH2 H2N O O O O Gd3+ N N N O O O O N H N H N N H H O O O O Gd3+ O O O O TFA/ 0°C/ 1h -2 -2 CO2 778,9 g/mol C24H40GdN7O12 578,7 g/mol C14H27GdN7O8 Bei 0°C unter N2-Atmosphäre wurden 100mg des Bis-tert-butylcarbamoylhydrazidoDTPA-Gd-Komplexes mit 1ml einer Lösung bestehend aus 950μl Trifluoressigsäure /25μl H2O/ 25μl Diisopropylsilan versetzt. Die Lösung wurde 1h bei 0°C gerührt. Im Anschluss wurden alle flüchtigen Bestandteile im Ölpumpenvakuum entfernt. Es blieb ein farbloses viskoses Öl zurück. ESI-MS(DMF): positiv m/z: 690 [M-2H+2Na+K]+ , 668 [M-H+Na+K]+ , 652 [M-H+2Na]+ , 646 [M+K]+ , 630 [M+Na]+ negativ m/z: 644 [M-2H+K]- , 628 [M-2H+Na]- , 606 [M-H]- 9.9 Allgemeine Synthese von fluorierten bzw. trifluormethylierten BenzylDTPA-diester bzw. bisamid-Liganden In einem 50ml Rundkolben mit Magnetrührstäbchen und Anschützaufsatz werden 300mg (0,84mM)DTPA-Bis-anhydrid in 10ml DMF (trocken) vorgelegt, auf 60°C erwärmt bis sich sämtliches DTPA-Bis-anhydride gelöst hat, und die Lösung homogen wird. Jetzt werden 2,2 eq (1,76mmol) des fluorierten Eduktes zugegeben und weitere 4h auf 60°C erhitzt. Alle flüchtigen Bestandteile werden im Ölpumpenvakuum entfernt. Es bleibt ein öliger Rückstand zurück, der nach Erhitzen im Ölpumpenvakuum farblos mit DMF amorph auskristallisierte. Der weiße Feststoff wird mit 10ml Chloroform und 10ml Ether gewaschen und 4h im Ölpumpenvakuum getrocknet. Experimenteller Teil 72 9.10 Allgemeine Synthese von fluorierten bzw. trifluormethylierten BenzylDTPA-diester bzw. bisamid-Komplexen In einem 200ml Erlenmeyerkolben werden 0,1g fluorierter-DTPA-Ligand in 50ml Wasser und 20ml Ethanol gelöst, bis sämtlicher Feststoff (Ligand) gelöst ist. Es wird 1 eq. GdCl3×6H20 zugegeben und der pH-Wert der Komplexierung kontrolliert. Es wird mit 0,1M-NaOH bis pH=7 titriert und weitere 10min stehen gelassen und erneut auf pH=7 eingestellt wurde. Mittels einer 20ml Spritze wird das Reaktionsgemisch aufgenommen und durch eine mit bidest. Wasser vorkonditionierten Festphasenkartusche entsalzt und an einer Gefriertrocknungsanlage lyophilisiert. 9.11 Bis-(4-Fluorbenzylamido)-DTPA-Ligand und Gd(III)-Komplex NH2 F O N N N O OH O O O O O N N N O OH O O N H N H O OH O OH F F + 2 357,3 g/mol C14H19N3O8 125,2 g/mol C7H8FN 607.6 g/mol C28H35F2N5O8 Ausbeute: 483mg (94% d. Th.) Smp.: 120°C 1 H-NMR(360 MHz, d6-DMSO): t 8,67ppm (2H, NH), m 7,29ppm (4H, H-Aromat),m 7,09ppm (2H, H-Aromat), d 4,43–4,44 (4H, CH2-benzyl), s 3,38ppm (4H, DTPA-CH2- ), s 3,34ppm (2H, DTPA-CH2), s 3,29ppm (2H, DTPA-CH2), breites t 2,99 ( 4H, DTPA-CH2), t 2,84ppm (4H, DTPA-CH2) 13C-NMR(360 MHz, d6-DMSO) 172,8ppm (DTPA-COOH), 170,4ppm (DTPA-CONH), 169,4ppm (DTPA-COOH Zentral), d 159,6ppm (-CF), 135,7ppm (C-Aromat-benzyl), 128,1ppm (C-Aromat), 114,4 (C-Aromat), 57,5ppm (DTPA-CH2), 55,3ppm (DTPACH2), 55,0ppm (DTPA-CH2), 52,1 (DTPA-CH2), 41,2 (DTPA-CH2). 19F-NMR(360 MHz, d6-DMSO): m -130,8ppm (F-Aromat). ESI-MS(DMF): positiv m/z: 690 [M-2H+2Na+K]+ , 668 [M-H+Na+K]+ , 652 [M-H+2Na]+ , 646 [M+K]+ , 630 [M+Na]+ negativ m/z: 644 [M-2H+K]- , 628 [M-2H+Na]- , 606 [M-H]- Komplexierung: Experimenteller Teil 73 GdCl3 /H2 O/ NaOH NaCl N N N O OH O O N H N H O OH O OH F F N N N O O O O N H N H O O O O Gd3+ F F -3 607.6 g/mol C28H35F2N5O8 761,8g/mol C28H32F2GdN5O8 Ausbeute: 120mg (96% d. Th.) Smp.: 280°C Zersetzung 19F-NMR(360 MHz, H2O ohne Deuteriumlock): m -92,9ppm ESI-MS(H2O) positiv m/z: 785 [M+Na]+ , 763 [M+H]+ negativ m/z: 797 [M-H+2H2O]- , 761 [M-H]- 9.12 Bis-(3,5-Bis-Trifluormethylbenzylamido)-DTPA-Ligand und Gd(III)- Komplex NH2 CF CF3 3 O N N N O OH O O O O O N N N O OH O O N H N H O OH O OH CF3 CF3 CF3 CF3 + 2 243,21 g/mol C9H7F6N 357,32 g/mol C14H19N3O8 843,74 g/mol C32H33F12N5O8 Ausbeute: 503mg (71% d. Th.) Smp.: 110°C 1 H-NMR(360MHz, d6-DMSO): t 9,02ppm 2H(CONHRf), s 7,93ppm (4H, H-Aromat), s 7,91ppm ( 2H, H-Aromat), d 4,43 – 4,40ppm ( 4H, CH2), s 3,38ppm (4H, CH2- C(O)NH-), s 3,31ppm (8H, -CH2-),t 2,98 ( 4H, -CH2-),t 2,85ppm ( 4H, -CH2-) 13C-NMR(360MHz, d6-DMSO): 172,7ppm (DTPA-COOH), 170,9ppm (C(O)NH), 169,2ppm (DTPA-COOH), 129,8ppm (C-CF3-Aromat), 127,9ppm (C-Aromat), 124,8ppm (–C-Aromat), 57,6ppm (CH2-DTPA), 55,4ppm (CH2-DTPA), 54,9ppm (CH2-DTPA), 52,3ppm (CH2-Ethylen), 41,2ppm (CH2-Ethylen). 19F-NMR: (360 MHz, DMSO): -61,8ppm (-CF3) ESI-MS(DMF) positiv: 904 [M-H+Na+K]+ , 888 [M-H+2Na]+ , 882 [M+K]+ , 866 [M+Na]+ , 844 [M+H]+ negativ: 904 [M-3H+ +Zn+ ] - , 880 [M-2H+K]- , 864 [M-2H+Na]- , 842 [M-H]- Komplexierung Experimenteller Teil 74 GdCl3 /H2 O/ NaOH NaCl N N N O OH O O N H N H O OH O OH CF3 CF3 CF3 CF3 N N N O O O O N H N H O O O O Gd3+ CF3 CF3 CF3 CF3 -3 843,74 g/mol C32H33F12N5O8 1000,99 g/mol C32H30GdN5O8 Ausbeute: 56mg (47% d. Th.) Smp.: 230°C Zersetzung 19F-NMR(360 MHz, H2O ohne Deuteriumlock): breites s -68,1ppm ESI-MS(DMF) positiv: 1023[M+Na]+ , 1001 [M+H]+ negativ: 999 [M-H]- , 1035 [M+Cl]- 9.13 Bis-(3,5-Bis-Trifluormethylbenzyl)-DTPA-diester-Liganden OH CF CF3 3 O N N N O OH O O O O O N N N O OH O O O O O OH O OH CF3 CF3 CF3 CF3 + 2 244,14 g/mol C9H6F6O 357,32 g/mol C14H19N3O8 845,6 g/mol C32H31F12N3O10 Ausbeute: 248mg (35% d. Th.) Smp.: 105°C 1 H-NMR(360 MHz, d6-DMSO): s 8,09ppm ( 4H, o-H-Aromat), s 7,97ppm (2H, p-HAromat), s 5,26ppm (s, 4H, benzyl-CH2), s 4,68 ppm(2H, CH2-DTPA), s 3,68ppm (4H, CH2-DTPA-Ester), s 3,46ppm (4H, CH2-DTPA), t (breit) 2,98ppm (4H, CH2- DTPA-Ethylen),t (breit) 2,88ppm (4H, -CH2-DTPA-Ethylen) 13C-NMR(360 MHz, d6-DMSO): 172,25ppm (DTPA-COOH), 170,51ppm (DTPACOO), 162,0ppm (DTPA-COOH), q 130,0 ppm (CF3), q 129,8ppm ( C-Aromaten an CF3), 128,4ppm (C-Aromat), 124,4 (C-Aromat), 63,7ppm (DTPA-CH2), 54,75ppm (DTPA-CH2), 54,36ppm (DTPA-CH2), 51,45ppm (DTPA-CH2), 49,818 (DTPA-CH2). 19F-NMR(360 MHz, D6-DMSO): -61,890ppm ESI-MS(DMF): positiv: 982 [M-3H+Na+3K]+ , 960 [M-2H+3K]+ , 944 [M-2H+Na+2K]+ , 928 [M-2H+2Na+K]+ , 906 [MH+Na+K]+ , 890 [M-H+2Na]+ , 884 [M+K]+ , 868 [M+Na]+ , 846 [M+H]+ .- negativ: 882 [M-2H+K]- , 866 [M-2H+Na]- , 844 [M-H]- .- Experimenteller Teil 75 9.14 Bis-(3,5-Bis-Trifluormethylbenzyl)-DTPA-diester-Gd-Komplex GdCl3 /DMF/ NEt3 NET3HCl N N N O OH O O O O O OH O OH CF3 CF3 CF3 CF3 N N N O O O O O O O O O O Gd3+ CF3 CF3 CF3 CF3 -3 845,6 g/mol C32H31F12N3O10 1002,8 g/mol C32H28GdN3O10 In 10ml trockenem DMF werden unter N2-Atmosphäre 136mg (0,16mmol) Bis-(3,5- Bis-trifluormethylbenzyl)-DTPA-diester mit 56mg (0,15mmol) GdCl3·6H2O gelöst. Dann werden 3,2 Äq. Triethylamin(56,5mg) 78l mittels einer Spritze zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 6h bei 60°C gerührt und im Anschluss im Ölpumpenvakuum vom Lösungsmittel und überschüssigem Triethylamin befreit. Der feste Rückstand wurde mit 5×2ml Ether gewaschen, um Triethylammoniumhydrochlorid zu entfernen. Ausbeute: 81mg (68% d. Th.) Smp.: 208°C Zersetzung 19F-NMR(360 MHz, H2O ohne Deuteriumlock): breites s -59,154ppm ESI-MS(DMF): positiv: 1023[M+Na]+ , 1001 [M+H]+ negativ: 999 [M-H]- , 1035 [M+Cl]- 9.15 Allgemeine Synthese von steroidsubstituierten DTPA-diester-Liganden In einem 50ml Schlenk-Kolben mit Magnetrührstäbchen werden 300mg (0,84mM) DTPA-Bis-Anhydrid in 10ml DMF (trocken) vorgelegt, auf 60°C erwärmt bis sich sämtliches DTPA-Bis-Anhydride löst. Jetzt werden 2 Äq (1,76mM) des Steroids zugegeben und weitere 8h auf 60°C gehalten. Alle flüchtigen Bestandteile werden im Ölpumpenvakuum entfernt. Der erhaltene ölige Rückstand kristallisiert farblos mit DMF unter erhöhter Temperatur im Ölpumpenvakuum aus. Anschließend wird das Produkt mit 2×10ml Aceton und 10ml Chloroform gewaschen und 4h im Ölpumpenvakuum getrocknet. Experimenteller Teil 76 9.16 Bis-(11,17,21-trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-21)-DTPA-diester [BisCortisol-DTPA-diester] O O HO OH OH O N N N O OH O O O O O O O OH O O N HO O N N O HO O O OH O O HO O OH HO 2 + 357,32 g/mol C14H19N3O8 362,47 g/mol C21H30O5 1082,26 C56H79N3O18 N 27 26 N 24 25 O HO 20 21 O 22 23 O OH 15 17 16 14 13 12 11 8 9 6 7 5 10 1 2 3 O 4 <10> <13> 18 19 O HO O OH Ausbeute: 754mg (83% d. Th.) Smp.: 145-148°C unter Zersetzung 1 H-NMR(360MHz, d6-DMSO): s 0,78ppm (CH3-C13´), m 0,87ppm (CH-9), m 1,27ppm/1,67ppm (CH2-15), s 1,37ppm (CH3-C10´), 1,44ppm/2,50ppm (CH2-16), 1,78ppm/2,10ppm (CH2-1), m 1,92ppm/1,67ppm (CH2-12), m 1,67ppm (CH-14), m 1,93ppm (CH-8), m 1,93ppm/0,99ppm (CH2-7), m 2,18ppm/2,38ppm (CH2-2), m 2,18ppm/2,45ppm (CH2-6), t 2,88ppm( CH2-27-DTPA),t 2,96ppm (CH2-27-DTPA), s 3,47ppm (CH2-22-DTPA), s 3,49ppm (CH2-24-DTPA), s 3,66ppm (CH2-21-DTPA), 4,23ppm (CH-OH-11), 4,80ppm/5,13ppm (CH2-19), 5,56ppm (=CH-4) 13C-NMR(360MHz, d6-DMSO): 16,5ppm (CH3-C13´), 20,4ppm (CH3-C10´), 23,2ppm (CH2-15), 31,0ppm (CH-8), 31,3ppm (CH2-6), 32,7ppm (CH2-7), 33,0ppm (CH-16), 33,3ppm (CH2-2), 33,9ppm (CH-1), 38,7ppm (Cq-10), 46,7ppm (Cq-13), 49,9ppm (CH2-26-DTPA), 51,5ppm (CH2-27-DTPA), 51,5ppm (CH-14), 54,2ppm (CH2-21- DTPA), 54,4ppm (CH2-22-DTPA), 54,9ppm (CH2-24-DTPA), 55,4ppm (CH-9), 66,2ppm (CH-OH-11), 67,5ppm (CH2-19), 88,5ppm (Cq-OH-17), 121,3ppm (=CH-4), 169,5ppm (DTPA-25-COOH), 170,2ppm (DTPA-20-COOH), 172,2ppm (=Cq-5), 172,3ppm (COOH-23-DTPA), 197,9ppm (CO-3), 205,0ppm (CO-18) ESI-MS:(DMF) positiv m/z: 1082 [M+H]+ , [M+K]+ 1120 negativ m/z: 1080 [M-H]- Experimenteller Teil 77 RF = 0,9 (Ethanol/Wasser 3:2) 9.17 Bis-(11,21-dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion-21)-DTPA-diester [BisCorticosteron-DTPA-diester] O O HO OH O N N N O OH O O O O O O O OH O O N HO O N N O HO O O OH O O HO O + 2 346,47 g/mol C21H30O4 357,32 g/mol C14H19N3O8 1050,26 g/mol C56H79N3O16 N 27 26 N 24 25 O HO 20 21 O 22 23 O OH 15 17 16 14 13 12 11 8 9 6 7 5 10 1 2 3 O 4 <10> <13> 18 19 O HO O Ausbeute: Gemisch 599mg (68% d. Th.) Smp.: 140-143°C unter Zersetzung 1 H-NMR(360MHz, d6-DMSO): s 0,80 ppm (CH3-C13´), m 0,92ppm (CH-9), m 1,27ppm/1,67ppm (CH2-15), s 1,36ppm (CH3-C10´), 1,60ppm/2,05ppm (CH2-16), 1,78ppm/2,11ppm (CH2-1), m 1,50ppm/2,13ppm (CH2-12), m 1,10ppm (CH-14), m 1,88ppm (CH-8), m 1,91ppm/0,97ppm (CH2-7), m 2,19ppm/2,37ppm (CH2-2), m 2,18ppm/2,44ppm (CH2-6), 2,51ppm (CH-17), t 3,04ppm( CH2-27-DTPA),t 2,91ppm (CH2-27-DTPA), s 3,47ppm (CH2-22-DTPA), s 3,56ppm (CH2-24-DTPA), s 3,66ppm (CH2-21-DTPA), 4,22ppm (CH-OH-11), m 4,73ppm (CH2-19), 5,56ppm (=CH-4) 13C-NMR(360MHz, d6-DMSO): 15,2ppm (CH3-C13´), 20,3ppm (CH3-C10´), 24,0ppm (CH2-15), 31,0ppm (CH-8), 31,2ppm (CH2-6), 32,4ppm (CH2-7), 21,7ppm (CH-16), 33,4ppm (CH2-2), 34,0ppm (CH-1), 38,8ppm (Cq-10), 15,2ppm (Cq-13), 49,8ppm (CH2-26-DTPA), 51,6ppm (CH2-27-DTPA), 56,8ppm (CH-14), 54,1ppm (CH2-21- DTPA), 54,4ppm (CH2-22-DTPA), 54,9ppm (CH2-24-DTPA), 55,4ppm (CH-9), 66,0ppm (CH-OH-11), 68,8ppm (CH2-19), 58,5ppm (CH-17), 121,4ppm (=CH-4), 169,2ppm (DTPA-25-COOH), 170,2ppm (DTPA-20-COOH), 172,2ppm (=Cq-5), 172,4ppm (COOH-23-DTPA), 198,0ppm (CO-3), 203,4ppm (CO-18) Experimenteller Teil 78 ESI-MS(DMF): )positiv m/z 1050 [M+H]+ , [M+Na]+ 1072 negativ m/z 1048 [M-H]- , 1110 [M-3H+Zn] - 9.18 Bis-(9-Fluor-16-methyl-11,17,21-trihydroxy-3,20-pregnandion-21)- DTPA-diester [Bis-Dexamethason-DTPA-diester] O O HO OH OH F O N N N O OH O O O O O O O OH O O N HO O N N O HO O O OH O O HO O OH F F 2 + 357,32 g/mol C14H19N3O8 1126,27 g/mol C58H77F2N3O17 392,47 g/mol C22H29FO5 N 27 26 N 24 25 O HO 20 21 O 22 23 O OH 15 16 17 14 13 12 11 8 9 6 7 5 10 1 2 3 O 4 <10> <13> 18 19 O HO O OH<16> F Ausbeute: 222mg (23% d. Th.) Smp.: 198-200°C unter Zersetzung 1 H-NMR(360MHz, d6-DMSO): s 0,79ppm (CH3-16), s 0,89ppm (CH3-13), m 1,35ppm/ 1,77ppm (CH2-7), s 1,49ppm (CH3-10), m 1,63ppm/ 1,07ppm (CH2-15), 2,15ppm/ 1,63ppm (CH2-12), 2,12ppm (CH-14), 2,32ppm/ 2,62ppm (CH2-6), m 2,35ppm (CH2- 8) 3 JHF=29,6Hz, 2,88ppm (CH-16), t 2,92ppm( CH2-26-DTPA),t 3,09ppm (CH2-27- DTPA), 3,43ppm (CH2-24-DTPA), s 3,47ppm (CH2-22-DTPA), s 3,67ppm (CH2-21- DTPA), m 4,16ppm (CH-OH-11) 3 JHF=10,4Hz, 4,85ppm/5,05ppm (CH2-19), 6,00ppm (=CH-4), 6,22ppm (=CH-2), 7,29ppm (=CH-1) 13C-NMR(360MHz, d6-DMSO): 15,1ppm (CH3-16), 16,2ppm (CH3-13), 22,9ppm (CH3-10), 27,2ppm (CH2-7), 30,2ppm (CH2-6), m 33,5ppm (CH-8) 2 JCF=19,3Hz, 35,3ppm (CH-16), 35,4ppm (CH2-12), 43,2ppm (CH-14), m 47,9ppm (Cq-10) 2 JCF=22,7Hz, 47,9ppm (Cq-13), 49,5ppm (CH2-26-DTPA), 51,5ppm (CH2-27-DTPA), 54,2ppm (CH2-21-DTPA), 54,4ppm (CH2-24-DTPA), 68,1ppm (CH2-19), 55,4ppm (CH2-22-DTPA), m 70,5ppm (CH-OH-11) 2 JCF=36,7Hz, 90,4ppm (Cq-OH-17), m Experimenteller Teil 79 101,1ppm (Cq-F-9) 1 JCF=175Hz, 124,0ppm (=CH-4), 128,9ppm (=CH-2), 152,7ppm (=CH-1), 167,0ppm (=Cq-5), 170,3ppm (COOH-20-DTPA), 172,4ppm (COOH-23- DTPA), 172,4ppm (COOH-25-DTPA), 185,2ppm (CO-3), 204,7ppm (CO-18) 19F-NMR(360MHz, d6-DMSO): m -164,9ppm ESI-MS: (DMF) negativ: [M-H]- 1140, [M-2H+Na]- 1162, [M-2H+K]- 1178 positiv: [M+H]+ 1142, [M+Na]+ 1164, [M+K]+ 1180, [MH+Na+K]+ 1202, [M-H+2K]+ 1218, [M-2H+2K+Na]+ 1241 9.19 Bis-(17,21-dihydroxy-4-pregnen-3,11,20-trion-21)-DTPA-diester [BisCortison-DTPA-diester] O O O OH OH O N N N O OH O O O O O O O O O O N HO O N N O HO O O OH O O O O OH HO 2 + 357,32 g/mol C14H19N3O8 1078,23 g/mol C56H75N3O18 360,45 g/mol C21H28O5 N 27 26 N 24 25 O HO 20 21 O 22 23 O OH 15 17 16 14 13 12 11 8 9 6 7 5 10 1 2 3 O 4 <10> <13> 18 19 O O O OH Ausbeute: Gemisch 706 mg(78% d. Th.) Smp.: 192-195°C unter Zersetzung 1 H-NMR(360MHz, d6-DMSO): s 0,49ppm (CH3-C13´), m 2,14ppm (CH-9), m 1,34ppm/1,79ppm (CH2-15), s 1,32ppm (CH3-C10´), 1,66ppm/2,52ppm (CH2-16), 1,66ppm/2,55ppm (CH2-1), m 2,90ppm/2,16ppm (CH2-12), m 2,02ppm (CH-14), m 1,90ppm (CH-8), m 1,88ppm/1,22ppm (CH2-7), m 2,11ppm/2,41ppm (CH2-2), m 2,26ppm/2,42ppm (CH2-6), t 2,88ppm( CH2-26-DTPA),t 2,95ppm (CH2-27-DTPA), s 3,46ppm (CH2-22-DTPA), s 3,49ppm (CH2-24-DTPA), s 3,65ppm (CH2-21-DTPA), 4,83ppm/5,02ppm (CH2-19), 5,64ppm (=CH-4) Experimenteller Teil 80 13C-NMR(360MHz, d6-DMSO): 14,8ppm (CH3-C13´), 16,7ppm (CH3-C10´), 22,6ppm (CH2-15), 35,8ppm (CH-8), 31,5ppm (CH2-6), 31,8ppm (CH2-7), 33,6ppm (CH-16), 33,2ppm (CH2-2), 33,8ppm (CH-1), 37,6ppm (Cq-10), 50,5ppm (Cq-13), 50,2ppm (CH2-26-DTPA), 51,6ppm (CH2-27-DTPA), 48,9ppm (CH-14), 49,5ppm (CH-12), 54,0ppm (CH2-21-DTPA), 54,4ppm (CH2-22-DTPA), 54,8ppm (CH2-24-DTPA), 60,9ppm (CH-9), 67,9ppm (CH2-19), 87,8ppm (Cq-OH-17), 123,5ppm (=CH-4), 172,3ppm (DTPA-25-COOH), 170,4ppm (DTPA-20-COOH), 169,0ppm (=Cq-5), 172,4ppm (COOH-23-DTPA), 198,1ppm (C=O-3), 205,1ppm (C=O-18), 209,9ppm (C=O-11) ESI-MS(DMF) negativ: [M-H]- 1076 positiv: [M+H]+ 1078, [M+Na]+ 1100, [M+K]+ 1116 9.20 Bis-(5-Androstan-3-ol-17-on-3)-DTPA-diester [Bis-Androsteron-DTPAdiester] O O O N HO O N N O HO O O O OH O HO O O N N N O OH O O O O O + 2 357,32 g/mol C14H19N3O8 290,45 g/mol C19H30O2 938,22 g/mol C52H79N3O12 N 25 24 N 26 27 O HO 20 21 O O 22 23 O OH 15 16 17 14 13 12 11 8 9 6 7 5 10 1 2 3 4 O <13> <10> Ausbeute: Gemisch 496mg (63% d. Th.) Smp.: 207-210°C unter Zersetzung 1 H-NMR(600MHz, d6-DMSO): m 0,70ppm (CH-9), s 0,77ppm(CH3-C13´), s 0,81ppm (CH3-C10´), m 0,95ppm/1,73ppm (CH2-7), 1,00ppm/1,69ppm (CH2-1), 1,17ppm (CH2-5), 1,22ppm (CH-14), 1,25ppm/1,57ppm (CH2-11), 1,27ppm (CH2-6), 1,50ppm (CH-8), 1,33ppm/1,56ppm (CH2-4), 1,44ppm/1,76ppm (CH2-2), 1,45ppm/1,82ppm (CH2-15), 1,12ppm/1,63ppm (CH2-12), 1,97ppm/2,38ppm (CH2-16), t 2,87ppm (CH2- Experimenteller Teil 81 24-DTPA), t 3,01ppm (CH2-25-DTPA), s 3,40 ppm (CH2-22-DTPA), s 3,43 ppm (CH2- 26-DTPA), s 3,50 ppm (CH2-21-DTPA), 4,62ppm (CH-3), 13C-NMR(600MHz, d6-DMSO): 11,8 ppm (CH3-19), 13,3 ppm (CH3-19), 20,0ppm (CH2-11), 21,2ppm (CH2-15), 27,1ppm (CH2-2), 27,8ppm (CH2-6), 30,4ppm (CH2-7), 33,6ppm (CH2-4), 34,3ppm (CH-8), 35,2ppm (Cq-10), 35,1ppm (CH2-16), 36,1ppm (CH2-1), 44,0ppm (CH-5), 47,0ppm (Cq-13), 49,9ppm (CH2-24-DTPA), 50,6ppm (CH- 14), 51,7ppm (CH2-25-DTPA), 53,6ppm (CH-9), 54,7ppm (CH2-21-DTPA), 54,8ppm (CH2-22-DTPA), 55,5ppm (CH2-26-DTPA), 73,0 ppm (CH-3), 170,3 ppm (COOH-20), 172,5 ppm (COOH-23), 172,5 ppm (COOH-27), 219,6 ppm (CO-17), ESI-MS(DMF) positiv [M+H]+ 938, [M+Na]+ 960, [M+K]+ 976 negativ [M-H]- 936, [M-3H+Zn2+] - 998 9.21 Bis-(3-Hydroxy-5-Cholan-24-carbonsäure-3)-DTPA-diester [BisLithocholsäure-DTPA-diester] O O N HO O N N O HO O O O OH CH3 CH3 H H H H OH O H HO O HO CH3 CH3 H HO O H H H O N N N O OH O O O O O 2 + 357,32 g/mol C14H19N3O8 1110,49 g/mol C62H99N3O14 376,58 g/mol C24H40O3 N 25 24 N 26 27 O HO 20 21 O O 22 23 O OH 15 16 17 14 13 12 11 8 9 6 7 5 10 1 2 3 4 31 <13> <10> H <31> 32 33 34 HO O Ausbeute: Gemisch 504mg (54% d. Th.) Smp.: 170-175°C unter Zersetzung 1 H-NMR(360MHz, d6-DMSO): s 0,62ppm (CH3-C13´), s 0,91ppm (CH3-C10´), m 0,87ppm (CH3-C31´), m 1,37ppm (CH-9), m 1,03ppm/1,53ppm (CH2-15), 1,79ppm/1,24ppm (CH2-16), 1,01ppm/1,76ppm (CH2-1), m 1,18ppm/1,93ppm (CH2- Experimenteller Teil 82 12), m 1,09ppm (CH-14), m 1,35ppm (CH-8), m 1,37ppm/1,06ppm (CH2-7), 1,36ppm/1,18ppm (CH2-11) 1,78ppm/1,49ppm (CH2-4), m 1,63ppm/1,36ppm (CH2- 2), m 1,81ppm/1,22ppm (CH2-6), 1,08ppm (CH-17), m 1,36ppm (CH-31), m 1,67ppm/1,18ppm (CH2-32), m 2,21ppm/2,10ppm (CH2-33), t 3,00ppm( CH2-27- DTPA), t 2,89ppm (CH2-26-DTPA), s 3,43ppm (CH2-22-DTPA), s 3,53ppm (CH2-24- DTPA), s 3,50ppm (CH2-21-DTPA), m 4,65ppm (CH-O-C3) 13C-NMR(360MHz, d6-DMSO): 11,8ppm (CH3-C13´), 18,1ppm (CH3-C31´), 20,3ppm (CH2-11), 22,9ppm (CH3-C10´), 23,8ppm (CH2-15), 25,9ppm (CH2-7), 26,3ppm (CH2- 2), 26,5ppm (CH2-6), 27,6ppm (CH2-16), 30,6ppm (CH2-32), 30,65ppm (CH2-33), 31,9ppm (CH2-4), 34,0ppm (Cq-10), 34,5ppm (CH2-1), 34,8ppm (CH-31), 35,8ppm (CH-8), 39,5ppm (CH2-12), 39,8ppm (CH-9), 41,2ppm (CH-5), 42,2ppm (Cq-13), 49,9ppm (CH2-26-DTPA), 51,7ppm (CH2-27-DTPA), 54,5ppm (CH2-21-DTPA), 55,0ppm (CH2-22-DTPA), 55,0ppm (CH2-24-DTPA), 55,4ppm (CH-17), 55,8ppm (CH-14), 73,7ppm (CH-O-C3), 169,5ppm (DTPA-25-COOH), 170,2ppm (DTPA-20- COOH), 172,4ppm (COOH-23-DTPA), 174,7ppm (COOH-34) ESI-MS: positiv m/z 1110 [M+H]+ , [M+Na]+ 1132 negativ m/z 1108 [M-H]- 9.22 Bis-(5-Cholesten-3)-DTPA-diester [Bis-Cholesterin-DTPA-diester] O O N HO O N N O HO O O O O OH H O N N N O OH O O O O O + 2 386,67 g/mol C27H46O 1130,66 g/mol C68H111N3O10 357,32 g/mol C14H19N3O8 Ausbeute: Gemisch 587mg (62% d. Th.) Smp.: 215-217°C unter Zersetzung 1 H-NMR und 13C-NMR (360MHz, d6-DMSO+d5-Pyridin, T=60°C): aufgrund der starken Aggregationseffekte wurden unzureichende Spektren erhalten die keine genauere Zuordnung erlaubten ESI-MS negativ: [M-2H+Na]- 1150, [M-2H+K]- 1166, [M-3H+Na+K]-· 1191 positiv: [M+Na+K]+· 1191, Experimenteller Teil 83 9.23 Allgemeine Synthese von Steroid-DTPA-Gd(III)-diester Komplexen In einem 200ml Erlenmeyerkolben wird 200mg des steroidsubstituierten DTPALigand in 40ml Wasser und 20ml Ethanol gelöst bis sämtlicher Feststoff (Ligand) in Lösung gegangen ist. Danach wird 1 Äq. GdCl3×6H20 zugegeben und der pH-Wert potentiometrisch kontrolliert. Es wird mit 0,1M-NaOH bis pH=7 titriert und weitere 10min stehen gelassen und nochmals auf pH=7 eingestellt. Mittels einer 20ml Spritze wird das Reaktionsgemisch aufgenommen und durch eine mit bidest. Wasser vorkonditionierte Festphasenkartusche (QMA-Excell plus®) entsalzt und anschließend an einer Lyophille gefriergetrocknet. 9.24 Bis-(5-Cholesten-3)-DTPA-diester-Gd(III)-Komplexes [Bis-CholesterinDTPA-diester-Gd] O O N HO O N N O HO O O O OH N O O O O N O O N O O O O Gd3+ 1130.66 g/mol C68H111N3O10 1287,91 g/mol C68H108GdN3O10 GdCl3/NaOH/EtOH/H2O -3NaCl Ausbeute: Gemisch 109mg (48% d. Th.) Smp.: 240°C unter Zersetzung ESI-MS(DMF): positiv m/z: 1288 [M+H]+ , 1310 [M+Na]+ negativ m/z: 1286 [M-H]- , 1308 [M-2H+Na]- 9.25 Bis-(11,17,21-trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-21)-DTPA-dieste-Gd(III)- Komplexes [Bis-Cortisol-DTPA-diester-Gd] O N HO O N N O HO O O O OH O O HO OH O O O HO OH N O O O N O N O O O O Gd3+ O O O HO OH O O O HO OH 1082.26 g/mol C56H79N3O18 1239,51 g/mol C56H76GdN3O18 GdCl3/NaOH/EtOH/Wasser -3NaCl Ausbeute: Gemisch 149mg (61% d. Th.) Smp.: 222°C unter Zersetzung ESI-MS(DMF): positiv m/z: 1240 [M+H]+ , 1263 [M+Na]+ ,1311 [M-H+Na+K]+ negativ m/z: 1239 [M-H]- , 1261 [M-2H+Na]- Experimenteller Teil 84 9.26 Bis-(17,21-dihydroxy-4-pregnen-3,11,20-trion-21)-DTPA-diester-Gd(III)- Komplexes [Bis-Cortison-DTPA-diester-Gd] O N HO O N N O HO O O O OH O O O OH O O O HO O N O O O N O N O O O O Gd3+ O O O O OH O O O HO O 1078.23 g/mol C56H75N3O18 1232,48 g/mol C56H72GdN3O18 GdCl3/NaOH/EtOH/H2O -3NaCl Ausbeute: Gemisch 112mg (49% d. Th.) Smp.: 204°C unter Zersetzung ESI-MS(DMF): positiv m/z: 1236 [M+H]+ , 1258 [M+Na]+ negativ m/z: 1234 [M-H]- , 1256 [M-2H+Na]- 9.27 Bis-(3-Hydroxy-5-Cholan-24-carbonsäure-3)-DTPA-diester-Gd(III)- Komplexes [Bis-Lithocholsäure-DTPA-diester-Gd] O N HO O N N O HO O O OH O CH3 CH3 H HO O H H H O CH3 CH3 H OH O H H H N O O O N O N O O O O Gd3+ O CH3 CH3 H OH O H H H O CH3 CH3 H HO O H H H 1110,49 g/mol C62H99N3O14 1264,74 g/mol C62H96GdN3O14 GdCl3/NaOH/EtOH/H2O -3NaCl Ausbeute: Gemisch 152mg (67% d. Th.) Smp.: 221°C unter Zersetzung ESI-MS(DMF): positiv m/z: 1265 [M+H]+ , 1287 [M+Na]+ , 1325 [M-H+Na+K] negativ m/z: 1263 [M-H]- , 1285 [M-2H+Na]- , 1301 [M-2H+K]- 9.28 Bis-(5-Androstan-3-ol-17-on-3)-DTPA-diester-Gd(III)-Komplexes [BisAndrosteron-DTPA-diester-Gd] O N HO O N N O HO O O OH O CH3 CH3 H H H O CH3 CH3 H H H O O N O O O N O N O O O O Gd3+ O CH3 CH3 H H H O CH3 CH3 H H H O O 938,22 g/mol C52H79N3O12 1092,47 g/mol C52H76GdN3O12 GdCl3/NaOH/EtOH/Wasser -3NaCl Ausbeute: Gemisch 74mg (32% d. Th.) Experimenteller Teil 85 Smp.: 198°C ESI-MS(DMF): positiv m/z: 1093 [M+H]+ , 1132 [M+K]+ , 1116 [M+Na]+ negativ m/z: 1091 [M-H]- , 1113 [M-2H+Na]- , 1129 [M-2H+K]- 9.29 Bis-(9-Fluor-16-methyl-11,17,21-trihydroxy-3,20-pregnandion-21)- DTPA-diester-Gd(III)-Komplexes [Bis-Dexamethason-DTPA-diester-Gd] O N HO O N N O HO O O O OH O O HO OH O O O HO OH F F N O O O N O N O O O O Gd3+ O O O HO OH O O O HO OH F F 1142,27 g/mol C58H77F2N3O18 1296,52 g/mol C58H74F2GdN3O18 GdCl3/NaOH/EtOH/Wasser -3NaCl Ausbeute: Gemisch 83mg (37% d. Th.) Smp.: 176°C ESI-MS(DMF): positiv m/z: 1297 [M+H]+ , 1319 [M+Na]+ negativ m/z: 1295 [M-H]- , 1329 [M+Cl]- 9.30 Bis-(11,21-dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion-21)-DTPA-diester-Gd(III)- Komplexes [Bis-Corticosteron-DTPA-diester-Gd] O N HO O N N O HO O O O OH O O HO O O O OH N O O O N O N O O O O Gd3+ O O O HO O O O OH 1050.23 g/mol C56H79N3O16 1204,51 g/mol C56H76GdN3O16 GdCl3/NaOH/EtOH/Wasser -3NaCl Ausbeute: Gemisch 100mg (44% d. Th.) Smp.: 219°C unter Zersetzung ESI-MS(DMF): positiv m/z: 1205 [M+H]+ , 1227 [M+Na]+ negativ m/z: 1203 [M-H]- , 1225 [M-2H+Na]- , 1261 [M-H+Na+Cl]- 9.31 Allgemeine Synthese von Bis-Steroid-TTHA-Liganden Zu 100mg TTHA-Bisanhydrid (0,218mmol) werden 2 eq. Steroid (Dexamathason, Prednison, Cortison, Hydrocortison) in einem 10ml Schlenk-Kolben gegeben und in 5ml DMF (trocken) auf 60-70°C für 6h erwärmt. Im Anschluss wird das Lösungsmittel im Ölpumpenvakuum abgezogen, der braune Rückstand mehrmals mit Acetonitril gewaschen und 6h an der Ölpumpe getrocknet. Experimenteller Teil 86 9.32 Bis-(9-Fluor-16-methyl-11,17,21-trihydroxy-3,20-pregnandion-21)- TTHA-diester [Bis-(Dexamethason)-TTHA-diester] O O HO OH OH F O N O O N N O OH O O O N O HO N N O HO O O OH O O HO O OH F O O OH O HO O N HO O F N OH O 2 + 458,43 g/mol C18H26N4O10 392,47 g/mol C22H29FO5 1243,39 g/mol C62H84F2N4O20 N 27 26 N 24 25 O HO 20 21 O 22 23 O OH 15 16 17 14 13 12 11 8 9 6 7 5 10 1 2 3 O 4 <10> <13> 18 19 O HO O OH <16> F 28 Ausbeute: Gemisch 186mg (69% d. Th.) Smp: Zersetzung 160-165°C 1 H-NMR(360MHz, d6-DMSO): s 0,81ppm (CH3-C16´), s 0,91ppm (CH3-C13´), m 1,37ppm/1,78ppm (CH2-7), s 1,50ppm (CH3-10), m 1,65ppm/ 1,08ppm (CH2-15), 2,16ppm/ 1,62ppm (CH2-12), 2,14ppm (CH-14), 2,32ppm/ 2,63ppm (CH2-6), 2,34ppm (CH2-8), 2,91ppm(CH-16), t 2,86ppm( CH2-26-TTHA),t 2,87ppm (CH2-27- TTHA) , 2,95ppm (CH2-28-TTHA), s 3,43ppm (CH2-24-TTHA), s 3,47ppm (CH2-22- TTHA), s 3,66ppm (CH2-21-TTHA), 4,16ppm (CH-OH-11), 4,84ppm/ 5,10ppm (CH2- 19), 6,00ppm (=CH-4), 6,21ppm (=CH-2), 7,30ppm (=CH-1) 13C-NMR(360MHz, d6-DMSO): 14,8ppm (CH3-C16´), 16,0ppm (CH3-C13´), 22,7ppm (CH3-C10´), 27,0ppm (CH2-7), 30,0ppm (CH2-6), 33,4ppm (CH-8), 35,1ppm (CH-16), 31,7ppm (CH2-15), 43,0ppm (CH-14), 47,7ppm (Cq-10), 47,7ppm (Cq-13), 35,4ppm (CH2-12), 51,6ppm (CH2-27-TTHA), 50,6ppm (CH2-28-TTHA), 50,4ppm (CH2-26- TTHA), 54,8ppm (CH2-24-TTHA), 54,4ppm (CH2-22-TTHA), 54,2ppm (CH2-21- TTHA), 67,7ppm (CH2-19), 70,4ppm (CH-OH-11), 90,2ppm (Cq-OH-17), 100,9ppm (Cq-F-9), 123,9ppm (=CH-4), 128,7ppm (=CH-2), 152,4ppm (=CH-1), 166,6ppm (=Cq-5), 170,3ppm (COOH-25-TTHA), 172,1ppm (COOH-23-TTHA), 170,1ppm (COOH-20-TTHA), 184,9ppm (CO-3), 204,3ppm (CO-18) 19F-NMR(360MHz, d6-DMSO): m -164,9ppm ESI-MS: (DMF) negativ: [M-H]- 1241 Experimenteller Teil 87 positiv: [M+H]+ 1243, [M+Na]+ 1265 9.33 Bis-(17,21-dihydroxy-4-pregnen-3,11,20-trion-21)-TTHA-diester [BisCortison-TTHA-diester] O O O OH OH O N O O N N N O OH O O O OH O O O O O HO O N HO O N N O HO O O OH O O O O OH N OH O 2 + 458,43 g/mol C18H26N4O10 360,45 g/mol C21H28O5 1179,34 g/mol C60H82N4O20 28 N 27 26 N 24 25 O HO 20 21 O 22 23 O OH 15 17 16 14 13 12 11 8 9 6 7 5 10 1 2 3 O 4 <10> <13> 18 19 O O O OH Ausbeute: Gemisch 155mg (60% d. Th.) Smp.: Zersetzung 185-189°C 1 H-NMR(360MHz, d6-DMSO, T=40°C): s 0,49ppm (CH3-C13), s 1,32ppm (CH3-C10), m 1,35ppm/ 1,79ppm (CH2-15), m 1,24ppm/ 1,90ppm (CH2-7), 2,16ppm/ 2,91ppm (CH2-12), 2,43ppm/ 2,26pm (CH2-6), 2,41/ 2,12 ppm (CH2-2), 2,55/ 1,67 ppm (CH2- 1), 1,91ppm (CH2-8), 1,65/ 2,55ppm (CH2-16), 2,38ppm (CH-14), 1,91ppm (CH-9), 2,13ppm (CH-9), 1,90/ 1,24ppm (CH2-7), t 2,86ppm (N-CH2-26-TTHA),s 2,94 ppm (N-CH2-28-TTHA), s 3,46 ppm (CH2-22-TTHA), s 2,88 ppm (CH2-27-TTHA), s 3,43ppm (CH2-24-TTHA), 4,83ppm/ 5,03ppm (CH2-19), 5,63 ppm (=CH-4) 13C-NMR(360MHz, d6-DMSO, T=60°C): 14,9 ppm (CH3-C13), 16,6ppm (CH3-C10), 31,6ppm (CH2-7), 31,4ppm (CH2-6), 35,7ppm (CH-8), 49,6ppm (CH2-12), 22,5ppm (CH2-15), 33,6ppm (CH2-16), 49,1ppm (CH-14), 37,7ppm (Cq-10), 49,0ppm (Cq-13), 51,7ppm (CH2-27-TTHA), 55,0ppm (CH2-24-TTHA), 50,4ppm (CH2-26-TTHA), 50,9ppm (CH2-28-TTHA), 54,4ppm (CH2-22-TTHA), 54,2ppm (CH2-21-TTHA), 61,9ppm (CH-9), 33,6ppm (CH2-1), 87,7ppm (Cq-OH-17), 67,9ppm (CH2-19), 123,5ppm (=CH-4), 33,1ppm (CH2-2), 168,9ppm (=Cq-5), 170,1ppm (COOH-20- Experimenteller Teil 88 TTHA), 172,3ppm (COOH-23 -TTHA), 169,5ppm (COOH-25-TTHA), 198,1ppm (CO- 3), 205,0ppm (CO-18), 209,7 ppm (CO-11) ESI-MS: (DMF) negativ: [M-H]- 1177 positiv: [M+H]+ 1179, [M+Na]+ 1202 9.34 Bis-(17,21-dihydroxy-1,4-pregnadien-3,11,20-trion-21)-TTHA-diester [Bis-Prednison-TTHA-diester] O O O OH OH O N O O N N N O OH O O O OH O O O O O HO O N HO O N N O HO O O OH O O O O OH N OH O + 2 458,43 g/mol C18H26N4O10 358,4 g/mol C21H26O5 1175,31 g/mol C60H78N4O20 28 N 27 26 N 24 25 O HO 20 21 O 22 23 O OH 15 17 16 14 13 12 11 8 9 6 7 5 10 1 2 3 O 4 <10> <13> 18 19 O O O OH Ausbeute: Gemisch 124mg (49% d. Th.) Smp.: 173-176°C unter Zersetzung 1 H-NMR(360MHz, d6-DMSO, T=60°C): s 0,54ppm (CH3-C13), s 1,37ppm (CH3-C10), m 1,39ppm/ 1,78ppm (CH2-15), m 1,22ppm/ 2,00ppm (CH2-7), 2,20ppm/ 2,92ppm (CH2-12), 2,52ppm/ 2,37ppm (CH2-6), 2,05ppm (CH2-8), 1,68/ 2,58ppm (CH2-16), 2,37ppm (CH-14), 2,16ppm (CH-9), 1,68/ 2,58ppm(CH2-16), t 2,85ppm( N-CH2-29- TTHA),s 2,90 ppm (N-CH2-28-TTHA), s 3,46 ppm (CH2-22-TTHA), s 3,64ppm (CH2- 21-TTHA), s 3,43ppm (CH2-26-DTPA), 4,83ppm/5,02ppm (CH2-19), 6,01 ppm (=CH- 4), 6,10 ppm (=CH-2), 7,60 ppm (=CH-1) 13C-NMR(360MHz, d6-DMSO, T=60°C): 14,7 ppm (CH3-C13), 18,5ppm (CH3-C10), 32,9ppm (CH2-7), 31,3ppm (CH2-6), 35,3ppm (CH-8), 49,1ppm (CH2-12), 22,5ppm (CH2-15), 33,3ppm (CH2-16), 48,5ppm (CH-14), 41,7ppm (Cq-10), 50,2ppm (Cq-13), 51,7ppm (CH2-25-TTHA), 50,6ppm (CH2-24-TTHA), 54,8ppm (CH2-26-TTHA), 50,9ppm (CH2-28-DTPA), 54,4ppm (CH2-22-TTHA), 55,2ppm (CH2-21-TTHA), Experimenteller Teil 89 58,9ppm (CH-9), 35,3ppm (CH-8), 87,1ppm (Cq-OH-17), 67,6ppm (C-19), 12 3,5ppm (=CH-4), 126,7ppm (=CH-2), 154,4ppm (=CH-1), 166,7ppm (=Cq-5), 170,3ppm (COOH-20-TTHA), 172,3ppm (COOH-27-TTHA), 172,0ppm (COOH-23-TTHA), 184,7ppm (CO-3), 204,7ppm (CO-18), 209,6 ppm (CO-11) ESI-MS: (DMF) negativ: [M-H]- 1173 positiv: [M+H]+ 1175, [M+Na]+ 1197 9.35 Bis-(11,17,21-trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-21)-TTHA-diester [BisCortisol-TTHA-diester] O O HO OH OH O N O O N N N O OH O O O OH O O O OH O HO O N HO O N N O HO O O OH O O HO O OH N OH O + 2 458,43 g/mol C18H26N4O10 1183,34 g/mol C60H86N4O20 362,47 g/mol C21H30O5 28 N 27 26 N 24 25 O HO 20 21 O 22 23 O OH 15 17 16 14 13 12 11 8 9 6 7 5 10 1 2 3 O 4 <10> <13> 18 19 O HO O OH Ausbeute: Gemisch 211mg (82% d. Th.) Smp.: 153-155°C unter Zersetzung 1 H-NMR(360MHz, d6-DMSO, T=60°C): s 0,79ppm (CH3-C13´), m 0,87ppm (CH-9), m 1,28ppm/1,67ppm (CH2-15), s 1,37ppm (CH3-C10´), 1,43ppm/2,54ppm (CH2-16), 1,80ppm/2,11ppm (CH2-1), m 1,93ppm/1,68ppm (CH2-12), m 1,67ppm (CH-14), m 1,93ppm (CH-8), m 1,93ppm/1,00ppm (CH2-7), m 2,19ppm/2,38ppm (CH2-2), m 2,19ppm/2,45ppm (CH2-6), t 2,88ppm( CH2-27-TTHA),t 2,86ppm (CH2-26-TTHA), t 2,94ppm (CH2-28-TTHA), s 3,47ppm (CH2-22-TTHA), s 3,44ppm (CH2-24-TTHA), s 3,65ppm (CH2-21-TTHA), 4,27ppm (CH-OH-11), 4,80ppm/5,15ppm (CH2-19), 5,56ppm (=CH-4) 13C-NMR(360MHz, d6-DMSO, T=60°C): 16,4ppm (CH3-C13´), 20,3ppm (CH3-C10´), 23,2ppm (CH2-15), 30,9ppm (CH-8), 31,1ppm (CH2-6), 32,7ppm (CH2-7), 32,7ppm Experimenteller Teil 90 (CH-16), 33,2ppm (CH2-2), 33,9ppm (CH-1), 38,8ppm (CH2-15), 38,7ppm (Cq-10), 46,7ppm (Cq-13), 50,6ppm (CH2-28-TTHA), 50,4ppm (CH2-26-TTHA), 51,7ppm (CH2-27-TTHA), 51,3ppm (CH-14), 54,3ppm (CH2-21-TTHA), 54,5ppm (CH2-22- TTHA), 54,9ppm (CH2-24-TTHA), 55,4ppm (CH-9), 66,3ppm (CH-OH-11), 67,4ppm (CH2-19), 88,5ppm (Cq-OH-17), 121,3ppm (=CH-4), 169,5ppm (COOH-25-TTHA), 170,1ppm (COOH-20-TTHA), 172,1ppm (=Cq-5), 172,3ppm (COOH-23-TTHA), 197,7ppm (CO-3), 204,9ppm (CO-18) ESI-MS: (DMF)positiv m/z 1183[M+H]+ , [M+Na]+ 1205, [M+K]+ 1221 negativ m/z 1181 [M-H]- , 1203 [M-2H+Na]- , 1219 [M-2H+K]- , 1241 [M-3H+K+Na]- 9.36 Allgemeine Synthese von Steroid-TTHA-Gd(III)-diester Komplexen In einem 200ml Erlenmeyerkolben werden 100mg des steroidsubstituierten TTHALiganden in 40ml Wasser und 20ml Ethanol vollständig gelöst. Danach wird 1 Äq. GdCl3×6H20 zugegeben. Die Komplexierung wird durch potentiometrische pH-WertKontrolle durchgeführt. Mit 0,1M-NaOH wird bis pH=5,5 titriert und weitere 10min stehen gelassen und erneut auf pH=5,5 eingestellt. Mittels einer 20ml Spritze wird das Reaktionsgemisch aufgenommen und durch eine mit bidest. Wasser vorkonditionierte Festphasenkatusche entsalzt und an einer Lyophille gefriergetrocknet. 9.37 Bis-(9-Fluor-16-methyl-11,17,21-trihydroxy-3,20-pregnandion-21)- TTHA-diester-Gd(III)-Komplex [Bis-Dexamethason-TTHA-diester-Gd] -NaCl N N O HO O O OH O O HO O OH O O OH O HO O N HO O N OH O F F O O OH O HO O N O O N O O O O O OH OHO N N O O O O Gd3+ F F 1243.37 g/mol C62H84F2N4O20 . 1396,64 g/mol C62H80F2GdN4O20 GdCl3 /NaOH Ausbeute: Gemisch 48mg (43% d. Th.) Smp.: 145-150°C unter Zersetzung Experimenteller Teil 91 ESI-MS(EtOH/Wasser 1:1) positiv m/z 1442 [M-2H+ +2Na+ ] + , 1458 [M-2H+ +Na+ +K+ ] + negativ m/z: 1396 [M-H+ ] - 9.38 Bis-(17,21-dihydroxy-1,4-pregnadien-3,11,20-trion-21)-TTHA-diesterGd(III)-Komplex [Bis-Prednison-TTHA-diester-Gd] GdCl3/NaOH/H2 O N N O HO O O OH O O O O OH O O O O HO O N HO O N OH O O O O O HO O N O O N O O O O O O OHO N N O O O O Gd3+ 1175.31 g/mol C60H78N4O20 1332,56 g/mol C60H74GdN4O20 -3NaCl -H2O Ausbeute: Gemisch 33mg (29% d. Th.) Smp.: 161-163°C unter Zersetzung ESI-MS:(EtOH/Wasser 1:1) positiv m/z: 1374 [M-2H+ +2Na+ ] + negativ m/z: 1328 [M-H+ ] - 9.39 Bis-(11,17,21-trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-21)-TTHA-diester-Gd(III)- Komplex [Bis-Cortisol-TTHA-diester-Gd-Komplex] N N O HO O O OH O O HO O OH O O OH O HO O N HO O N OH O O O OH O HO O N O O N O O O O O OH OHO N N O O O O Gd GdCl 3+ 3/NaOH/H2O 1183.37 g/mol C60H86N4O20 1340,62 g/mol C60H82GdN4O20 -3NaCl -H2O Ausbeute: Gemisch 75mg (67% d. Th.) Smp.: 198-200° unter Zersetzung Experimenteller Teil 92 ESI-MS(EtOH/Wasser 1:1): positiv m/z: 1382 [M-2H+ +2Na+ ] + negativ m/z: 1336 [M-H+ ] - 9.40 Bis-(17,21-dihydroxy-4-pregnen-3,11,20-trion-21)-TTHA-diester-Gd(III)- Komplex [Bis-Cortison-TTHA-diester-Gd] N N O HO O O OH O O O O OH O O O O HO O N HO O N OH O O O O O HO O N O O N O O O O O O OHO N N O O O O Gd GdCl 3+ 3/NaOH/H2O 1179.34 g/mol C60H82N4O20 1336,59 g/mol C60H82GdN4O20 -3NaCl -H2O Ausbeute: Gemisch 95mg (84% d. Th.) Smp.: 168-171°C unter Zersetzung ESI-MS: (EtOH/Wasser 1:1) positiv m/z 1356 [M+Na+ ] + , 1378 [M-H+ +2Na+ ] + negativ m/z 1332 [M-H+ ] - 9.41 Synthese des Bis-(Dipalmitoylphosphatidylethanolamido)-DTPALiganden N N N N H N H O O O OH O OH O OH O O P O O P O O O O O O O O HO O O OH NH2 O O P O O O O O OH O N N N O OH O O O O O + DMF/NEt3 /6h bei 60°C unter N2 1741,28 g/mol C88H167N5O24P2 357,32 g/mol C14H19N3O8 691,98 g/mol C37H74NO8P Zu 100mg (0,28mmol) DTPA-Bisanhydrid gelöst in 5ml trockenem DMF werden 385mg (0,56mmol) Dipalmitoylphosphatidylamin unter Stickstoffatmosphäre gegeben und auf 75°C erwärmt. Nach vollständigem Lösen aller Komponenten werden 2,2 Äquivalente Triethylamin zugegeben und weitere 6h bei 75°C gerührt. Nach Entfernen aller flüchtigen Bestandteile im Ölpumpenvakuum wird in 20ml Chloroform aufgenommen und mit Wasser(3×5ml) ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen der Experimenteller Teil 93 organischen Phase über Na2SO4 wurde das Lösungsmittel entfernt und weitere 4h im Ölpumpenvakuum getrocknet. N 26 27 N 21 6 N H O 24 22 23 25 O OH O OH 5 4 O O P O 2 3 O 1 O O CH1 2 CH2 2 (CH2) 10 O OH CH2 1 CH2 2 (CH2) 10 CH2 CH13 2 14 (A) CH3 CH2 13 14CH2 CH3 (B) Ausbeute: 326mg (67% d. Th.) Smp.: 95-98°C 1 H-NMR(360MHz, d6-DMSO+d4-Pyridin, T=60°C): t 8,36ppm (NH), m 4,37/4,17ppm (O-CH2-1), m 5,18ppm (O-CH2-C2), m 3,94ppm (O-CH2-C3), m 3,92ppm (O-CH2- C4), m 3,37ppm (NH-CH2), m 2,29ppm (Ra-CH2-C1), m 2,27ppm (Rb-CH2-1), m 1,53ppm (R-CH2-C2), m 1,23ppm (R-CH2-C3 bis C14), m 0,83ppm (R-CH3-C15), t 3,05ppm( CH2-27-DTPA), t 3,31ppm (CH2-26-DTPA), s 3,54ppm (CH2-22-DTPA), s 3,97ppm (CH2-24-DTPA), s 3,37ppm (CH2-21-DTPA) 13C-NMR(360MHz, d6-DMSO+d5-Pyridin, T=60°C): 61,9ppm (O-CH2-1), 70,1ppm (O-CH2-C2),d 62,7ppm 2 J13C31P = 6,2 Hz (O-CH2-C3, d 63,0ppm 2 J13C31P = 6,2 Hz (O-CH2-C4), 39,6ppm (NH-CH2), 33,4ppm (Ra-CH2-C1), 33,1ppm (Rb-CH2-1), 23,9ppm (R-CH2-C2), 28,1-28,6ppm (R-CH2-C3 bis C12), 30,8ppm (R-CH2-C13), 21,7ppm (R-CH2-C14), 13,2ppm (R-CH3-C15), 51,8ppm (CH2-27-DTPA), 50,0ppm (CH2-26-DTPA), 54,7ppm (CH2-22-DTPA), 53,1ppm (CH2-24-DTPA), 57,7ppm (CH2- 21-DTPA), 171,9ppm (R-COO), 170,1ppm (CONH-20-DTPA), 167,9ppm (DTPA-25- COOH), 171,8ppm (COOH-23-DTPA) 31P-NMR(360MHz, d6-DMSO+d5-Pyridin, T=60°C): m -0,44ppm (2 J H31P = 6,2 Hz) ESI-MS(DMF) negativ: [M-3H+Na+K]- 1800, [M-3H+2K]- 1816 [2M-5H+2K+NEt3H]2-· 1828, [M-2H+NEt3H]- 1841 positiv: [M+NEt3H]+ 1840, [M-H+Na+NEt3H]+ 1862 Experimenteller Teil 94 9.42 Synthese des Bis-(Dipalmitoylphosphatidylethanolamido)-DTPA-Gd(III)- Komplexes N N N N H N H O O O OH O OH O OH O O P O O P O O O O O O O O HO O O OH GdCl3 /DMF/NEt3 N N N N H N H O O O O O O O P O O P O O O O O O O O HO O O OH O O O Gd3+ 1741.28 g/mol C88H167N5O24P2 -3H+NEt3 Cl- 1898.53 g/mol C88H164GdN5O24P2 Zu 100mg (57,4μmol) Bis-dipalmitoylphophatidylethanolamido-DTPA-Liganden werden 21mg (56,6μmol) GdCl3×6H2O und 2ml trockenes DMF zugegeben und auf 60°C erwärmt bis alle Komponenten gelöst sind. Jetzt werden 3Äq. Triethylamin mittels einer Mikroliterpipette zugegeben und weitere 5h erwärmt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels im Ölpumpenvakuum wird der Rückstand in 20ml CHCl3 aufgenommen und 2×5ml Wasser ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen über MgSO4 wird das Lösungsmittel abgezogen und ein weißer Feststoff erhalten Ausbeute: 47mg (43% d. Th.) Smp.: 130-134°C unter Zersetzung ESI-MS(DMF) negativ: [M-2H]2- 870, [M-3H+Na+K]- 1800, [M-3H+2K]- 1166, [2M-5H+2K+ +NEt3H+ ] 2-· 1828, [M-2H+NEt3H]- 1841 positiv: 1840 [M+NEt3H]+ , 1862 [M-H+Na+NEt3H]+ 9.43 Synthese des Bis-(Dipalmitoylphosphatidylethanolamido)-TTHALiganden N N N N H O O OH O OH O OH O O P O O O O O OH N H O O P O O O O O N HO O O OH NH2 O O P O O O O O OH N N O OH O O O O N N O O O HO + DMF/DIPEA 8h 90°C unter N2 458,43 g/mol C18H26N4O10 691,98 g/mol C37H74NO8P 1842,38 g/mol C92H174N6O26P2 Zu 100mg (0,22mmol) TTHA-Bisanhydrid gelöst in 5ml trockenem DMF werden 299mg (0,433mmol) Dipalmitoylphosphatidylamin unter Stickstoffatmosphäre Experimenteller Teil 95 gegeben und auf 75°C erwärmt. Nach vollständigem Lösen aller Komponenten werden 2,2 eq. Triethylamin zugegeben und weitere 6h bei 75°C gerührt. Nach Entfernen aller flüchtiger Bestandteile im Ölpumpenvakuum wird in 20ml Chloroform aufgenommen und mit Wasser(3×5ml) ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen der organischen Phase über Na2SO4 wird das Lösungsmittel entfernt. N 26 27 N 28 21 6 N H O 24 22 23 25 O OH O OH 5 4 O O P O 2 3 O 1 O O CH1 2 CH2 2 (CH2)10 O OH CH2 1 CH2 2 (CH2)10 CH2 CH13 2 14 (A) CH3 CH2 13 14CH2 CH3 (B) Ausbeute: 128mg (32% d. Th.) Smp.: 157-161°C 1 H-NMR: (D6-DMSO+D5n-Pyridin) 360MHz bei 60°C: t 8,27ppm (NH), m 4,40/4,21 ppm (O-CH2-1), m 5,21ppm (O-CH-C2), m 3,96ppm (O-CH2-C3), m 3,91ppm (OCH2-C4), m 3,39ppm (NH-CH2), m 2,3ppm (Ra-CH2-C1), m 2,28ppm (Rb-CH2-1), m 1,54ppm (R-CH2-C2), m 1,23ppm (R-CH2-C3 bis C12), m 0,83ppm (R-CH3-C15), t 2,96ppm( CH2-27-TTHA), t 2,84ppm (CH2-26-TTHA), s 3,49ppm (CH2-22-TTHA), s 3,57ppm (CH2-24-TTHA), s 3,33ppm (CH2-21-TTHA), 13C-NMR: (D6-DMSO+D4-Pyridin) 360MHz bei 60°C: 62,0ppm (O-CH2-1), 70,1ppm (O-CH-C2),d 62,7ppm (O-CH2-C3), d 62,9ppm (O-CH2-C4), 39,6ppm (NH-CH2), 33,4ppm (Ra-CH2-C1), 33,2ppm (Rb-CH2-C1), 24,0ppm (R-CH2-C2), 28,2 (R-CH2-C3 bis C12), 30,8ppm (R-CH2-C13), 21,7ppm (R-CH2-C14), 13,4ppm (R-CH3-C15), 51,8ppm (CH2-27-TTHA), 51,4ppm (CH2-26-TTHA), 51,1ppm (CH2-28-TTHA), 55,3ppm (CH2-22-TTHA), 54,1ppm (CH2-24-TTHA), 58,1ppm (CH2-21-TTHA), 172,0ppm (R-COO), 170,1ppm (CONH-20-DTPA), 170,9ppm (TTHA-25-COOH), 171,8ppm (COOH-23-TTHA), 31P-NMR: (D6-DMSO+D4-Pyridin) 360MHz bei 60°C: m -0,44ppm ( J= 6,2 Hz) ESI-MS(DMF) negativ: [M-2H]2- 920, [M-H]- 1840, [M-2H+Na]- , [M-2H+K]- 1879 positiv: [M+H]+ 1842, [M+Na]+ 1865, [M+K]+ 1881 [MH+2Na]+ 1886, Experimenteller Teil 96 9.44 Synthese des Bis-Normorphin-DTPA-bisamid O OH OH H N H H O N N N O OH O O O O O O N HO O N N O HO O O OH O HO H N H HO O OH H N H OH 2 + 271,32 g/mol C16H17NO3 357,32 g/mol C14H19N3O8 899,96 g/mol C46H53N5O14 In einem 2ml Rundkolben werden 50mg (185mol) Normorphin mit 32,5mg (91mol) DTPA-Bis-anhydrid versetzt und in 2ml DMF(trocken) unter N2-Atmosphäre 6h auf 70°C erwärmt. Im Anschluss werden alle flüchtigen Bestandteile im Ölpumpenvakuum entfernt. Der feste amorphe Rückstand wird mit Chloroform und Ether jeweils 1 Mal gewaschen und 3h im Ölpumpenvakuum getrocknet. N 27 26 N 24 25 O HO 21 20 O 22 23 1 O OH 4 3 2 11 10 9 14 8 7 6 5 13 12 O HO H N 16 15 H HO Ausbeute: 68mg (83% d. Th.) Smp.: 112°C 1 H-NMR(360MHz, d6-DMSO): m 6,49ppm (CH=-C2),m 6,36ppm (CH=-C1), m 5,58 (CH=-C7), m 5,27 ppm (HC=-C8), 5,15ppm (CH-N-C9), m 4,69 ppm (=C-O-C5), m 4,11 ppm (CH(OH)=-C6), s 3,46 ppm (CH2-C24-DTPA),s 3,43ppm (CH2-C24-DTPA Brücke), s 3,66ppm (CH2-C21-DTPA), t 2,89ppm (CH2-C26-DTPA), t 2,94ppm (CH2- C27-DTPA), 3,03/3,80ppm (CH2-C16), 2,36ppm (CH-14), 2,51/ 2,79ppm (CH2-10), 1,70/1,97ppm (CH2-15) 13C-NMR(360MHz, d6-DMSO): 28,7ppm (CH2-C10), 35,4ppm (CH2-C15), 38,0ppm (CH2-C16), 39,2ppm (CH-C14), 43,4ppm (Cq-C13), 47,0ppm (CCH-N-C9), 50,7ppm (CH2-C26-DTPA), 51,5ppm (CH2-C27-DTPA), 54,8ppm (CH2-C24-DTPA), 55,4ppm (CH2-C22-DTPA), 55,8ppm (CH2-C21-DTPA), 66,0ppm (CH-OH-C6), 91,2ppm (OCH-C5), 116,7ppm (CH=-C2), 118,8ppm (CH=-C1), 123,8ppm (=Cq-C11), 127,1ppm (CH=-C8), 129,9ppm (=Cq-C12), 134,1ppm (CH=-C7), 138,7ppm (=C-OH-C3), Experimenteller Teil 97 146,3ppm (=C-O-C4), 168,0ppm (CONR1R2-C20), 169,8ppm (COOH-C25-DTPA), 172,2ppm (COOH-C23-DTPA) ESI-MS(DMF): positiv: [M+H]+ 900, [M+Na]+ 924, [M-H+Na+K]+ 962 negativ: [M-H]- 898, [M-2H+Na]- 922 9.45 Synthese des Bis-Normorphin-DTPA-bisamid-Gd-Komplexes O N HO O N N O HO O O OH O HO H N H HO O OH H N H OH N O O O O HO H N H HO N O N O O O OH H N H OH O O Gd3+ 899,96 g/mol C46H53N5O14 1054,21 g/mol C46H53GdN5O14 H2O/NaOH -3NaCl Zu 20mg (22μmol) Bis-Normorphin-DTPA-bisamid werden 8mg (22μmol) GdCl3×6H20 gegeben und unter pH-Messung mit 0,1M-NaOH-Lösung bis pH=7,4 titriert und nach 10 Minuten erneut auf pH=7 gebracht. Im Anschluss wird mittels einer Festphasenkatusche (QMA Waters®) entsalzt und an einer Gefriertrocknungsanlage lyophilisiert. Ausbeute: 22mg (94% d. Th.) Smp.: 245°C unter Zersetzung ESI-MS(DMF): positiv: [M+H]+ 1055, [M+Na]+ 1077, [M+K]+ 1093 negativ: [M-H]- 1053, [M+Cl]- 1089, 9.46 Synthese von -Cholesterylhydrazin O O S O N2H4 /MeOH/THF 2 3 4 1 10 5 6 7 9 8 12 11 13 14 15 17 16 <10> <13> 18 19 <18> 20 21 22 <22> <22> HN NH2 554,88 g/mol C35H54O3S -TsOH 414,72 g/mol C28H50N2 In einem 50ml Schlenk-Kolben werden unter N2-Atmosphäre 10ml THF und 10ml MeOH zu 0,5g (0,9mmol) -Cholesteryltosylat vorgelegt und 2ml (99% Hydrazin Monohydrat ) zugetropft und über 16 h bei RT gerührt. Im Anschluss wird eine Experimenteller Teil 98 weitere Stunde unter Rückfluss gekocht und alle flüchtigen Bestandteile im Ölpumpenvakuum entfernt. Der weiße Rückstand wurde mit CHCl3/ MeOH (1:9) auf Silikagel chromatographiert. Ausbeute: Gemisch 189mg (51% d. Th.) Smp.: 123-125°C 1 H-NMR(360MHz, CDCl3): s 0,65ppm (CH3-C13´), s 0,96ppm (CH3-C10´), m 0,90 ppm (CH3-C18´), m 0,88ppm (CH-9), m 1,33ppm/1,13ppm (CH2-15), 1,82ppm/1,25ppm (CH2-16), 1,01ppm/1,81ppm (CH2-1), m 1,12ppm/1,99ppm (CH2- 12), m 0,99ppm (CH-14), m 1,43ppm (CH-8), m 1,95ppm/1,47ppm (CH2-7), 1,45 ppm (CH2-11) 2,43ppm/2,26ppm (CH2-4), m 1,79ppm/1,71ppm (CH2-2), m 5,29ppm (CH=6), 1,09ppm (CH-17), m 1,36ppm (CH-18), m 1,33ppm/0,99ppm (CH2-19), m 1,56ppm/1,06ppm (CH2-20), m 1,11ppm( CH2-21), m 1,51ppm (CH-22), s 0,86ppm (CH3-C22´), m 4,31ppm (CH-NH-C3) 13C-NMR: (360MHz, CDCl3): 11,9ppm (CH3-C13´), 18,6ppm (CH3-C18´), 22,5ppm (CH3-C22´), 20,9ppm (CH2-11), 19,1ppm (CH3-C10´), 23,9ppm (CH2-15), 31,8ppm (CH2-7), 28,6ppm (CH2-2), 28,3ppm (CH2-16), 36,1ppm (CH2-19), 24,1ppm (CH2-20), 38,8ppm (CH2-4), 36,4ppm (Cq-10), 36,9ppm (CH2-1), 35,7ppm (CH-18), 31,6ppm (CH-8), 39,7ppm (CH2-12), 49,9ppm (CH-9), 42,2ppm (Cq-13), 39,4ppm (CH2-21), 28,0ppm (CH-22), 56,1ppm (CH-17), 56,6ppm (CH-14), 82,4ppm (CH-NH-C3), 123,7ppm (=CH-6), 138,8ppm (=Cq-5) EI-MS: [M] 400 Int. 60%, 385 [M-CH3] Int. 65%, 368 [M-N2H4]+ Int. 95% HR-MS: C27H48N2 calc. Masse 400,38175 gem. Masse 400,37143 m= 25,8ppm 9.47 Synthese des 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N´,N´´-tris-essigsäuretert-butylester (DO3A)[71] N N 1 2 3 N 4 N 5 O O 7 7 7 6 O O 8 8 8 O O H HN N H NH N H O O Br + 3 CH3CN/K2CO3/2h bei -18°C -3KBr -3CO2 -3H2O 172,28 g/mol C8H20N4 195,06 g/mol C6H11BrO2 514,71 g/mol C26H50N4O6 Experimenteller Teil 99 In einem 250ml Dreihalskolben mit Magnetrührstäbchen, Innenthermometer und Tropftrichter werden unter N2-Atmosphäre 3,4g (19,7mmol) 1,4,7,10- Tetraazacyclododekan (Cyclen) mit 8,2g (59,2mmol) K2CO3 versetzt und in 150ml trockenem CH3CN suspendiert. Dieses Gemisch wird 15 min bei RT gerührt und im Anschluss mit einer Eis/NaCl-Mischung auf -18°C gekühlt. Über den Tropftrichter werden über 2h sehr langsam 11,6g (59,5mmol) Bromessigsäure-tert-butylester gelöst in 100ml CH3CN getropft, wobei die Temperatur auf -18°C konstant gehalten wird. Nach vollständiger Zugabe lässt man langsam auf RT erwärmen und die Lösung weitere 24h rühren. Nach Abschluss der Reaktion wird über eine P4- Glasfritte filtriert. Das Lösungsmittel des Filtrats wird am Rotationsverdampfer entfernt und der ölige Rückstand in Toluol aufgenommen. Über Nacht kristallisiert das Produkt aus. Die isotherme Umkristalisation aus Toluol wird 3× wiederholt, um tetra-substituiertes Nebenprodukt vollständig zu entfernen. Ausbeute: 7,5g (74% d. Th.) Smp.: 181-182°C (Lit. 179°C)[71] 1 H-NMR(360MHz, CDCl3): s 1,44ppm 18H (CH3-7-tert-butyl), s 1,43ppm 9H (CH3-8- tert-butyl), t 2,94ppm 4H (CH2-1), t 2,84ppm 4H (CH2-2), t 2,71ppm 4H (CH2-3), s 3,36ppm 4H (CH2-5), s 3,27ppm 2H (CH2-6) 13C-NMR(360MHz, CDCl3): 28,1ppm (CH3-7-tert-butyl), 28,2ppm (CH3-8-tert-butyl), 45,2ppm (CH2-1), 48,0ppm (CH2-2), 49,3ppm (CH2-3), 51,6ppm (CH2-4), 58,1ppm (CH2-5), 48,6ppm (CH2-6), 80,5ppm (O-Cq ), 170ppm (COO-tert-butyl an 6), 170,6ppm (COO-tert-butyl an 5) EI-MS [M] 514 Int. 60%, 385 [M-CH3] Int. 65%, 368 [M-N2H4] + Int. 95% 9.48 Synthese des 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N´,N´´,-tris-essigsäuretert-butylester-N´´´-essigsäuremethylester (DOTA-OMe)[97] N N N N O O O O O O O OMe O Br O CH3 -KBr -CO2 -H 2O N N N N O O O O O O H + K2CO3/CH3CN/RT/12h 514,71 g/mol C26H50N4O6 152.98 g/mol C3H5BrO2 586,78 g/mol C29H54N4O8 Experimenteller Teil 100 1g (1,9mmol) DO3A und 805mg (5,7mmol) K2CO3 (wasserfrei) werden in einem 20ml Kolben mit Anschützaufsatz in 20ml trockenem Acetonitril unter Stickstoffatmosphäre vorgelegt. Nach 15 min. Rühren werden mit einer Mikroliterpipette 335mg (207μl) Bromessigsäuremethylester zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 12h bei Raumtemperatur gerührt. Im Anschluss werden alle flüchtigen Bestandteile im Ölpumpenvakuum entfernt. Zu dem Rückstand werden 10ml CHCl3 gegeben und die Suspension filtriert. Das Lösungsmittel wird erneut im Vakuum entfernt und der feste Rückstand über Silikagel mit (CH2Cl2/MeOH 95:5) als Laufmittel chromatographiert. Ausbeute: Gemisch 921mg (81% d. Th.) Smp.: 165°C 1 H-NMR(360MHz, CDCl3): Zuordnungen konnten aufgrund der starken Dynamik nicht getroffen werden! [87, 95, 96] 13C-NMR(360MHz, CDCl3): Zuordnungen konnten aufgrund der starken Dynamik nicht getroffen werden! [87, 95, 96] 1 H-NMR (CDCl3) (Lit. [97]) s 1,4 ppm (27H, tert-butyl), s 2,8 ppm (16H, CH2), s 3,2 ppm (6H), s 3,4 ppm (2H), s 3,6ppm (3H) ESI-MS:(MeOH) positiv: 587 [M+H], 609 [M+Na] 9.49 Synthese von N-Tert-butyl-carbamoyl-N´-Bromacetylbishydrazid[81-83] Br N H N H O O O Br Br O H2N N H O O + Et2O/NEt3 1h bei 0°C 201,85 g/mol C2H2Br2O 132,16 g/mol C5H12N2O2 -H+NEt3 Br- 253,10 g/mol C7H13BrN2O3 In einem 50ml Einhalskolben mit PVC-Septum wird 1g (7,5mmol) tert-Butylcarbazat in 15ml trockenem Ether unter N2-Atmosphäre gelöst. Im Anschluss werden 800mg/ 1,1ml (7,9mmol) trockenes Triethylamin zugegeben und das Reaktionsgemisch auf 0°C gekühlt. Mittels einer Spritze werden 1,5g/688μl (7,5mmol) über 30min zugetropft und das Gemisch im Anschluss weitere 2h gerührt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und das Filtrat mit 5ml ges. K2CO3-Lösung sowie mit Wasser(2×5ml) ausgeschüttelt. Die etherische Phase wird über Na2SO4 getrocknet und im Wasserstrahlvakuum auf die Hälfte eingeengt und unter Zugabe von wenig Hexan bei 0°C kristallisiert. Ausbeute: 1,81g (95% d. Th.) Smp.: 83°C [Lit. 85°C][81] Experimenteller Teil 101 1 H-NMR: (CDCl3) 360MHz: s 1,38ppm (9H, CH3-tert-butyl), s 3,81ppm (2H, BrCH2), breites s 6,64ppm (1H, NH), breites s 8,32ppm (1H, NH) 13C-NMR: (CDCl3) 360MHz: 27,9ppm (CH3-tert-butyl), 26,0ppm (CH2), 82,2ppm (Cq), 154,9ppm (COO), 165,1ppm (CONH) EI-MS [M] 253 Int. 60%, 197 [M-tert-butyl] 100%, [M-Br] Int. 65% 9.50 Synthese des 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N´,N´´-tris-essigsäuretert-butylester-N´´´-essigsäure-tert-butylcarbamoyldihydrazid (DOTABoc-hydrazid) N N H N N O O O O O O Br O N H N H O O N N N N O O O O O O O N H N H O O + CH3CN/K2CO3 48h bei RT -KBr -H2O -CO2 514,71 g/mol C26H50N4O6 253,10 g/mol C7H13BrN2O3 686,90 g/mol C33H62N6O9 In einem 50ml Einhalskolben mit PVC-Septum werden 300mg (0,58 mmol) DO3A in 5ml CH3CN(trocken) und anschließend mit 1,2Äq 96mg (0,70 mmol) K2CO3 versetzt. Diese Suspension wird 15 min bei Raumtemperatur unter N2-Atmosphäre gerührt. Zum Reaktionsgemisch werden mit einer Spritze langsam 1,2 Äq. 177mg (0,70mmol) Bromessigsäure-tert-butylcarbamoyldihydrazid in 5ml CH3CN über 1h zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 34h gerührt. Nach Ablauf dieser Zeit werden alle flüchtigen Bestandteile im Ölpumpenvakuum entfernt und zu dem Rückstand CHCl3 gegeben. Die Suspension wird mit 3×5ml Wasser ausgeschüttelt und die organische Phase über Na2SO4 getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels wird ein gelber Feststoff erhalten, der mittels Flash-SäulenChromatographie mit dem Laufmittel (CH2Cl2/MeOH) chromatographiert wird. Der Methanolanteil wird schrittweise auf 10% erhöht und im Anschluss wird die Säule mit reinem Methanol gespült. In der reinen Methanolfraktion befindet sich das Kaliumsalz , das nach dem Entfernen aller flüchtigen Bestandteile als gelber Feststoff zurück blieb. Ausbeute: 347mg (87% d. Th). Smp.: 191°C Experimenteller Teil 102 1 H-NMR: Zuordnungen konnten aufgrund der starken Dynamik nicht getroffen werden! [82, 85, 90, 91] 13C-NMR: Zuordnungen konnten aufgrund der starken Dynamik nicht getroffen werden! [82, 85, 90, 91] EI-MS: [M] 400 Int. 60%, 385 [M-CH3] Int. 65%, 368 [M-N2H4]+ Int. 95% HR-MS: C33H62N6O9 calc. Masse 686,45783 gem. Masse 686,45991 m= -2,1ppm, R=10000 9.51 Synthese des 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,-trisessigsäure-10- essigsäurehydrazid[72] N N N N O O O O O O O N H N H O O N N N N O OH O HO OH O O N H NH2 CF3COOH/0°C 5h -4C4H8 -CO2 686,90 g/mol C33H62N6O9 418,45 g/mol C16H30N6O7 In einem 10ml Rundkolben mit Magnetrührstäbchen werden 100mg (0,15mmol) DOTA-BOC-Hydrazid vorgelegt. Es werden 2ml eisgekühlte (95% Trifluoressigsäure /5% H2O) zugegeben und 2h bei 0°C gerührt. Zum Abschluss wird mit einem Wasserbad auf 60°C erwärmt und die Trifluoressigsäure im Ölpumpenvakuum abgezogen. Der ölige Rückstand wird mehrmals mit CHCl3 und Diethylether gewaschen. Der weiße Feststoff wird im Ölpumpenvakuum getrocknet. Ausbeute: Gemisch 45mg (73% d. Th.) Smp.: 210°C unter Zersetzung 1 H-NMR (D6-DMSO): Zuordnungen konnten aufgrund der starken Dynamik nicht getroffen werden! [82, 85, 90, 91] 13C-NMR (D6-DMSO): Zuordnungen konnten aufgrund der starken Dynamik nicht getroffen werden! [82, 85, 90, 91] ESI-MS(DMF): positiv: 419 [M+H]+ , 441 [M+Na]+ negativ: 418 [M-H]- , 440 [M-2H+Na]- Experimenteller Teil 103 9.52 Synthese des 1,4,7,10-Tetraazacyclododekan-N,N´,N´´,-tris-essigsäuretert-butylester-N-ethylalkohol N N N N O O O O O O H N N N N O O O O O O OH I OH K2CO3/CH3CN/RT/12h -KI -CO2 -H2O + 514,71 g/mol C2 6H5 0N4O6 171.97 g/mol C2H5 IO 558,77 g/mol C2 8H5 4N4O7 In einem 50ml Einhalskolben mit einem PVC-Gummiseptum werden 348mg (0,68 mmol) DO3A in 5ml CH3CN(trocken) gelöst. Im Anschluss werden 1,2Äq 118mg (0,83mmol) K2CO3 zugegeben und diese Suspension 15 min bei Raumtemperatur unter N2-Atmosphäre gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter Eiskühlung auf 0°C gebracht. Mittels einer Spritze werden langsam 1,2 Äq. 180mg (0,84mmol) 2- Iodethanol in 5ml CH3CN über 1h zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird langsam auf Raumtemperatur gebracht und weitere 12h bei RT und 12h unter Rückfluss gerührt. Im Anschluss werden alle flüchtigen Bestandteile im Ölpumpenvakuum entfernt und der Rückstand in CHCl3 aufgenommen und filtriert. Das Filtrat wird 3×5ml mit Wasser ausgeschüttelt und die organische Phase über Na2SO4 getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wird der ölige Rückstand aus 10ml Toluol/Hexan (3:1) isotherm umkristallisiert. Ausbeute: Gemisch 360mg (95% d. Th.) Smp.: 124°C 1 H-NMR (CDCl3): Zuordnungen konnten aufgrund der starken Dynamik nicht getroffen werden! [87, 95, 96] 13C-NMR (CDCl3): Zuordnungen konnten aufgrund der starken Dynamik nicht getroffen werden! [87, 95, 96] ESI-MS(MeOH): positiv: 558 [M+H]+ , 581 [M+Na]+ negativ: Experimenteller Teil 104 9.53 Synthese des Essigsäure-2-iodethylester H3C O O O H3C HO I O I H3C O + 102,09 g/mol C4H6O3 171,97 g/mol C2H5IO 214,00 g/mol C4H7IO2 30min/0°C Zu 538mg Essigsäureanhydrid wurden 96mg DIPEA unter Stickstoffatmosphäre getropft und das Reaktionsgemisch auf 0°C abgekühlt. Mittels einer Spritze wurden 1g 2-Iodoethanol über 30min unter starkem Rühren zugetropft. Nach vollständiger Zugabe wurde weitere 30min bei 0°C gerührt und im Anschluss 10ml Wasser zugegeben und die wässrige Phase mit 4×5ml Hexan extrahiert. Die organische Phase wurde mehrmals mit gesättigter NaHCO3-Lösung und Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und im Wasserstrahlvakuum fraktionierend destilliert. Ausbeute: 0,93g (75% d. Th) Sdp.: 87°C Wasserstrahlvakuum (Lit. 80°C bei 20 Torr)[89] 1 H-NMR(360MHz, CDCl3): s 2,06ppm (CH3), t 3,26ppm (CH2), t 4,29ppm (CH2) 13C-NMR(360MHz, CDCl3): 20,7ppm (CH3), 62,1ppm (CH2-I), 64,5ppm (CH2-O) EI-MS: [M] 214 Int. 4%, 154 [M-CH3COOH] Int. 32%, 87 [M-I] Int. 60%, 43 Int. [100%] HR-MS: ber. 213,94908 gef. 213,94965  =-0,6mmu 9.54 Synthese des 1,4,7,10-Tetraazacyclododekan-N,N´,N´´,-tris-essigsäuretert-butylester-N-ethylessigester N N N N O O O O O O H N N N N O O O O O O O CH3 O I O H3C O K2CO3/CH3CN/RT/12h -KI -CO2 -H2O + 514,71 g/mol C2 6H5 0N4O6 214.00 g/mol C4H7 IO2 600,80 C3 0H5 6N4O8 In einem 50ml Einhalskolben mit Gummiseptum werden 350mg (0,68 mmol)DO3A in 5ml CH3CN(trocken) gelöst und 1,2Äq 114mg (0,83mmol) K2CO3 zugegeben und diese Suspension 15 min bei Raumtemperatur unter N2-Atmosphäre gerührt. Anschließend wird auf 0°C gekühlt. Mittels einer Spritze werden langsam 1,2 Äq Experimenteller Teil 105 180mg (0,84mmol) Iodethylessigester in 5ml CH3CN über 1h zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird langsam auf Raumtemperatur erwärmt und weitere 30h gerührt. Nach Ablauf dieser Zeit werden alle flüchtigen Bestandteile im Ölpumpenvakuum entfernt und zu dem Rückstand CHCl3 gegeben. Die Suspension wird filtriert und die Chloroformphase 3×5ml mit Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Der ölige Rückstand wird aus 10ml Toluol/Hexan (3:1) isotherm umkristallisiert. Ausbeute: Gemisch 320g (78% d. Th.) Smp.: 141°C 1 H-NMR (CDCl3): Zuordnungen konnten aufgrund der starken Dynamik nicht getroffen werden! [87, 95, 96] 13C-NMR (CDCl3): Zuordnungen konnten aufgrund der starken Dynamik nicht getroffen werden! [87, 95, 96] EI-MS [M] 600 Int. 20%, [M-CH3] 585 Int. 4%, [M-CH3COO] 541 Int. 22%, [MCOO-tert-butyl] 499 Int. 100%, [[M-COO-tert-butyl]-CH3] 484 Int. 2%, [M-COO-tert-butyl-Gly] 430 Int. 30%,[M-COO-tert-butyl-vinylacetat] 413 Int. 80%, [M-COO-tert-butyl] 344 Int. 40% Literatur 106 Literatur [1] P. C. Lauterbur, Nature, 1973, 242, 190-191 (Image formation by induced local interactions: examples employing nuclear magnetic resonance) [2] L. Helm, Progr. Nucl. Magn. Res. Spectr., 2006, 49, 45-65 (Relaxivity in paramagnetic systems: Theory and mechanisms) [3] K. H. Chuang, A. Koretsky, Magn. Reson. Med., 2006, 55, 604-611 (Improved Neuronal Tract Tracing using Manganese Enhanced Magnetic Resonance Imaging with Fast T1 Mapping) [4] M. A. Perazella, R. A. Rodby, Semin. Dial., 2007, 20, 179-185 (Gadolinium use in patients with kidney diseases: a cause for concern) [5] M. Mailand, R. Waelchli, M. Ruat, H. G. W. M. Bodecke, K. 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Cockbrain, Patent WO95/28967, 1995 (Contrast Agents) Verwendete Abkürzungen I Verwendete Abkürzungen TFA Trifluoressigsäure TIPS Triisopropylsilan DIPEA Diisopropylethylamin TBTU Benztriazol-1-yl-tetramethyluronium tetrafluoroborat DCCI Dicyclohexylcarbodiimid Bzw. beziehungsweise NMR Nuclear Magnetic Resonance (Kernspinmagnetische Resonanz Spektroskopie) EPR Elektronen paramagnetische Resonanz (Electron paramagnetic resonance) T1 longitudinale Relaxationszeit T2 transversale Relaxationszeit R1 longitudinale Relaxivität R2 transversale Relaxivität  Inversionszeit DTPA Diethylentriamin-N,N´,N´´-pentaacetat TTHA Triethylentetramin-N,N´,N´´,N´´´-hexaacetat DOTA 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N´,N´´,N´´´-tetraacetat DO3A 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N´,N´´,-triacetat-1-Amin s.o. siehe oben KM Kontrastmittel UV/Vis Ultra Violett/ Sichtbarer Spektralbereich CT Computer Tomographie SPECT Single Photon Emmision Computer Tomography PET Positronen Emissions Tomography MRI Magnetic Resonance Imaging NMRD Nuclear Magnetic Resonance Dispersion MR Mineralocorticoid Rezeptor GR Glucocorticoid Rezeptor ZFS Zero field splitting (Nullfeld Aufspaltung) DMSO Dimethylsulfoxid Abb. Abbildung Verwendete Abkürzungen II B0 äußeres Magnetfeld DMF Dimethylformamid DTPA Diethylentriaminpentaessigsäure EI Elektronenstoss-Ionisation ESI Elektronenspray-Ionisation FCS fötales Kälberserum FID free induction decay (freier Induktionszerfall) FT Fourier-Transformation  gyromagnetisches Verhältnis HMBC Heteronuclear multiple bond correlation HPLC High Performance Liquid Chromatography (HochleistunsFlüssigkeitschromatographie) HSQC Heteronuclear single quantum coherence μ magnetisches Moment MDEFT Modified Driven Equilibrium Fourier Transform MeOH Methanol NOESY Nuclear Overhauser and Exchange Spectroscopy PBS Phosphate buffered saline (Phosphatpufferlösung) ppm parts per million (Teile pro Million) R molare Relaxivität RT Raumtemperatur TE Spin-Echo-Zeit SPIO Small Particles of Iron Oxide USPIO Ultrasmall Particles of Iron Oxide SNR Signal to noise ratio (Signal/Rausch-Verhältnis) Tabellen- und Abbildungsverzeichnis III Tabellen- und Abbildungsverzeichnis Abb.1 Strukturen von zugelassen MR-Kontrastmitteln (von rechts nach links Magnevist®, Omniscan®, Dotarem®, MS-325®)....................................... 3 Abb.2 Phospholipidstrukturen und der schematische Aufbau einer LipidDoppelschicht………………………………………………………………… 10 Abb.3 Konformation und systematische Nummerierung des Hydrocortisons.... 11 Abb.4 Strukturen der verwendeten Steroide...................................................... 11 Abb.5 Struktur des Gadophrins.......................................................................... 13 Abb.6 Strukturen pharmakologisch aktiver Hydrazinverbindungen.................... 13 Abb.7 Struktur von Hydrazid-Lanthanid Komplexen.......................................... 13 Abb.8 Polyfluorierte DO3A-Alkyl-Derrivate für die 19F-Tomographie................. 14 Abb.9 Von Duval et al. beschriebene opiatfunktionalisierte 111In-Komplexe (rechts) sowie autoradiographische Abbilder von Mäusegehirnen (links) 17 Abb.10 Schematischer Aufbau eines Eppendorff-Cup-Agarose-Gel-Phantom.... 21 Abb.11 Verwendete Pulsequenz für Inversion Recovery Messungen................. 22 Abb.12 Das EPR-Spektrum vom Bis-(2,4-Dinitrophenylhydrazido)-DTPA-GdKomplex zusammen mit der computergestützten dform-Simulation. Mit den EPR-Parametern g(eff) = 2.001, D = 370 Gauss, spektrale Bandbreite von: Bx = 900 Gauss, By = 850 Gauss, Bz = 570 Gauss 27 Abb.13 Tranmetallierungsreaktion eines Gd-(III)-DTPA-bishydrazid-Komplexes in Gegenwart von Zink in Phosphatpuffer pH=7...................................... 30 Abb.14 Links: Zerfallskurve der beiden Bishydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexe (Bis-(phenylhydrazido)-DTPA-Gd, Bis-(tert-butylcarbamoylhydrazido)- DTPA-Gd ) im direkten Vergleich (Normierte T1-Zeiten (Relaxivitäten) aufgetragen zur Reaktionszeit t) Rechts: Zerfallskurven von DTPA-bisamid-Gd(III)-Komplexen bestimmt von Laurent et al. ..................................................................... 31 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis IV Abb.15 19F-NMR-Spektren des Bis-(3,5-bistrifluoromethylbenzylamido)-DTPAGd(III)-Komplexes in H20 bei verschiedenen Temperaturen (276K- 306K) [c=1mmol/l]………………………………………………….……….. 37 Abb.16 Chemische Verschiebung [ppm] des intensivsten CF3- 19F-NMR-Signal aufgetragen zur Temperatur.................................................................... 38 Abb.17 Röntgenstruktur des TTHA-Gd(III)-Komplexes von Ruloff et al. ............. 41 Abb.18 MR-Abbild eines Eppendorff-cup-Agarosegelphantom mit bissteroidalen TTHA-Gd(III)-diester-Komplexen inkubierten C6-Glioma Zellen erhalten durch Messung mit einer MDEFT-Sequenz sowie eines vergrößerten Ausschnitts des gleichen Bildes auf der rechten Seite......................................................................................................... 45 Abb.19 Relaxivitätsabfall gemessen in Zellkulturmedium/5%FCS im zeitlichen Verlauf von ca. 29 Stunden...................................................................... 50 Abb.20 Zerfall des Opiatkontrastmittels............................................................... 51 Abb.21 Agarose-Gel-Phantom mit zweifach opiatfunktionalisierten Gd-DTPAKomplex inkubierten C6-Glioma-Zellen gemessen mit einer 3D-GEFIMR-Pulssequenz…………………………..………………………………... 52 Abb.22 Synthese eines DOTA-Doxorubicin-Gd(III)-Komplexes verknüpft über eine Hydrazidbrücke nach Frullano et al.[72]……………………………… 58 Tab.1 Wichtige Neurotransmitter für die Signaltransduktion im Gehirn[49 ,91]…. 15 Tab.2 Neuorotransmitter Rezeptor Agonisten mit den Bindungsspezifischen Strukturfragmenten soweit bekannt in rot dargestellt[48]………………… 16 Tab.3 T1-Zeiten der hergestellten Bis-Hydrazid-DTPA-Gd(III)-Komplexe in H2O bei verschieden Feldstärken …………………………………………. 29 Tab.4 Normierte Relaxivitäten von verschiedenen Gd(III)-Komplexen nach angegebener Reaktionszeit der Transmetallierungsreaktion mit Zn2+- Ionen…….…………………………………………………………………….. 31 Tab.5 Mittels halblogarithmischer Auftragung bestimmte T1-Zeiten des Wassersignals sowie des 19F-NMR-Signals in Wasser bzw. H2O/DMSO(4:1)……………………………………………………………... 36 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis V Tab.6 Änderung der chemischen Verschiebung des 19F-NMR-Signals bei 250MHz zwischen 26-46°C anhand einer 0,01mM-Komplexlösung des N-(2-hydroxy-2-trifluormethyl-ethyl)-N´,N´´,N´´´-tricarboxymethyl- 1,4,7,10-tetraazacyclodode-can-Pr(III)- bzw. Dy-Komplexes bestimmt.. 39 Tab.7 T1-Zeiten der Bis-corticosteroidalen-TTHA-Gd(III)-diester-Komplexe bei 8,5T bestimmt mittels halblgarithmischer Auftragung………………. 43 Tab.8 T1- und T2-Relaxationzeiten vom Bis-(Normorphin)-DTPA-bisamidGd(III)-Komplex in Zellkulturmedium……………………………………… 49 Tab.9 Alle synthetisierten Gd-Komplexe mit Parametern / Experimenten zur Übersicht…………………………………………………………………...… 59 Geräteliste VI Geräteliste: Mikrowaage: Sartorius-Werke GmbH Göttingen Typ 2492 NMR-Spektrometer -Avance WB-360 (Bruker Spektroskopie, Karlsruhe) Wide Bore Magnet 8,4 T, Temperiereinheit (B-VT 3000) -Avance NB-360 (Bruker Spektroskopie, Karlsruhe) Narrow Bore Magnet mit 8,4 T, Temperiereinheit (B-VT 3200) -Avance DRX-600 (Bruker Spektroskopie, Karlsruhe) Narrow Bore Magnet von Spectrospin mit 14,1 T, x,y,zGradienteneinheit (ACUSTAR II) Temperiereinheit (BVT 3000) Probenköpfe -HCP (TXI) 5 mm Inversprobenkopf mit z-Gradient -CPFH (QNP) 5 mm Probenkopf -HCP (TXI) 5 mm Inversprobenkopf mit z-Gradient -CH-Dualprobenkopf -HCN-5mm Inversprobenkopf x,y,z-Grad. -HPX-5mm Inversprobenkopf x,y,z-Grad. -HPX-8mm Inversprobenkopf z-Grad. -HX-2.5mm Inversprobenkopf z-Grad. -CH-5mm Dualprobenkopf z-Grad. -HCP-LC Inversprobenkopf z-Grad. pH-Elektrode Metter Inlab 417 Max. Temperatur bis 80 °C Massenspektrometer Bruker Esquire LC -HPLC(Agilent/HP 1100) -Ionenfalle mit MSn -Möglichkeit -Massenbereich: 50 - 2200 amu, max. bis 6000 amu Auflösungsvermögen: 0,6 amu FWHM -MAT 95 -Massenbereich: (5 kV Beschleunigungsspannung) 5-3500 amu; max. 17500 amu möglich -Auflösungsvermögen: im Routinebetrieb R = 1000 bis 2000 (je nach Molekülmasse); maximal ca. 20000 Geräteliste VII -Ionisationsmethoden: Elektronenstoß (EI), Fast Atom Bombardment (FAB) -Primärionenquelle: 20 kV Cs-Gun -Hochauflösung EI: R = 10000, peak matching -Finnigan MAT 8200 -Massenbereich: (bei 3 kV Beschleunigungsspannung): 5- 2000 amu -Auflösungsvermögen im Routinebetrieb R = 1000 bis 2000 (je nach Molekülmasse) -Ionisationsmethoden: Elektronenstoß (EI), Chemische Ionisation (CI) bzw. Direkte Chemische Ionisation (DCI); -Hochauflösung: EI: R = 10000, peak matching, CI/DCI: R = 5000 Lyophylisatoren -Christ LOC-1, Alpha 1-4, Typ 1004000, Baujahr 12/1990 - Christ, Beta I Typ 1104 Baujahr 5/1978 Mikroskop Olympus IX50, Olympus Optical Co, Model IX50-S8F2 Sterilbank Gelaire Model TC72,Baujahr 1988 Inkubator Heraeus Instruments Typ BB 6220 Zentrifugen -Hettich-Zentrifugen Universal 16R Danksagung VIII Danksagung Mein Dank gilt vor allem Herrn Prof. Dr. Leibfritz für die Möglichkeit zur Bearbeitung dieses interessanten Themas, für die ausgezeichneten Arbeitsbedingungen und seine stete Bereitschaft zur Diskussion und Beantwortung von Fragen. Der BFK danke ich für die finanzielle Unterstützung. Außerdem möchte ich mich bei allen Mitgliedern und ehemaligen Mitgliedern unserer Arbeitsgruppe bedanken: Dr. Peter Erhard, Dr. Wolfgang Dreher, Frau Marion Schilling, Dipl. Phys. Christian Schuster, Dr. Mathias Althaus, Dr. Christian Geppert, Dr. Thomas Dülks, Dr. Schiebel, Dr. Christine Glunde, Dipl. Phys. Dimitri Ebel, Frau Ingrid Killer, Dr. Ekkehart Küstermann, Dipl. Chem. Markus Plaumann, Dr. Jan Willmann Besonders bedanken möchte ich mich bei: Frau Dr. Claudia Zwingmann für die stete Unterstützung in biochemischen Fragen, Herrn Dr. Jörn Engelmann für den angenehmen Forschungsaufenthalt und seine großartige Unterstützung am Max-Plank-Institut für molekulare Kybernetik genauso danke ich Herrn Prof. Dr. Ugurbil und Herrn Prof. Dr. Logothetis. Frau Dipl. Chem. Ing. Dorit Kemken danke ich für die stete Hilfe bei der Auswertung und Aufnahme der Massenspektren. Herrn Dipl. Chem. Jan Köser danke ich für die anregenden Diskussionen und die Hilfe bei der Erstellung der Kurvenfit´s. Herrn Dr. Enno Lork danke ich für seine stete Bereitschaft Rötgenstrukturen für mich aufzunehmen. Herrn Dr. Mauricio Santos, Herrn Dr. Jost Klawitter, Frau Dr. Jelena Miljus, Frau Dr. Olga Tsaryova sowie Herrn Dipl. Chem. Nicky Philip, Herrn Dr. Touraj Shokati, Herrn Dr. Usachev, Herrn Dipl. Chem. Andreas Freund, cand. Chem. Torben König danke ich für die mir entgegengebrachte Freundschaft. Frau Dr. Simone Witt bin ich zu großem Dank verpflichtet. Danksagung IX Zum Ende meiner Danksagung möchte ich mich bei Herrn Dipl. Chem. Ing. Johannes Stelten bedanken, dessen moralische und fachliche Entscheidungshilfen bei Diskussionen für diese Arbeit essentiell waren. Ich danke meiner Frau und meiner Familie. Lebenslauf X Lebenslauf Persönliche Daten: Name: Timo Andree Dansauer Anschrift: Grenzstraße 38 28217 Bremen Geburtsdatum: 13.10.1976 Familienstand: verheiratet Staatsangehörigkeit: deutsch Schulausbildung: 1983-1987 Grundschule am Schulzentrum an der Melanchtonstraße in Bremen 1987-1989 Orientierungsstufe am Schulzentrum an der Helgoländer Straße in Bremen 1989-1993 (Realschule) Sekundarstufe I am Gerhard-RohlffsSchulzentrum in Bremen 1993-1996 (Gymnasiale Oberstufe)Sekundarstufe II am Schulzentrum an der Alwin-Lonke-Straße in Bremen Abschluss: Allgemeine Hochschulreife Wehrdienst: 1996-1997 Nachschubbataillon 11 in Schwanewede Hochschulausbildung: 1997-2003 Studium der Chemie an der Universität Bremen FBII abgeschlossen mit dem Erhalt des Diploms Thema:“Poly- und pertrifluormethylierte aromatische Verbindungen“ Seit 2004 Promotion am Institut für Organische Chemie an der Universität Bremen um Prof. Dr. Leibfritz Erklärung XI Erklärung: Ich versichere hiermit, dass ich diese Arbeit ohne fremde Hilfe erstellt habe und keine anderen Quellen und Hilfsmittel als die hier angegeben verwendet habe. Bremen, im Februar 2008